阿托伐他汀對實驗性肺纖維化的保護及其MMP-9、TIMP-1表達影響.pdf

1、本文研究目的：觀察阿托伐他汀對博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導的大鼠實驗性肺纖維化的形成過程是否具有保護作用，觀察阿托伐他汀對肺纖維化大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達的影響，初步探討阿托伐他汀抗肺纖維化的機制。基于成纖維細胞在肺纖維化形成中的作用以及是分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的關(guān)鍵細胞之一，觀察阿托伐他汀對其干預(yù)作用及其分泌的MMP-9、TIMP-1的影響，為探討阿托伐他汀抗肺纖維化作用的機制提供實驗依據(jù)。 研究材料與

2、方法： 博萊霉素氣管內(nèi)注入制備大鼠肺纖維化模型，分為模型2、4、6周組(M2、M4、M6)，阿托伐他汀亦按干預(yù)時間分為2、4、6周組(A2、A4、A6)。通過大體標本、肺泡灌洗液(BALF)、病理切片HE染色、Masson染色、酸解法測定肺組織羥脯胺酸的含量等方法，觀察肺泡炎、肺纖維化的情況。Gelatin Zymography明膠酶譜分析BALF的MMP-9活性；ELISA檢測肺泡灌洗液、血清中MMP-9、TIMP-1的濃度；

3、RT-PCR檢測肺組織MMP-9、TIMP-1mRNA的表達；Western-blot檢測肺組織MMP-9、TIMP-1的蛋白表達。博萊霉素制備大鼠肺纖維化模型，1周后處死，提取肺成纖維細胞，阿托伐他汀進行干預(yù)。MTT法測定細胞存活率；底物酶譜法分析Ⅳ型膠原酶的分泌及活性； [<'3>H]-脯氨酸滲入評價脯氨酸含量的變化；RT-PCR檢測細胞分泌的MMP-9、TIMP-1mRNA的表達；Western-blot檢測細胞培養(yǎng)液中MMP-9

4、、TIMP-1、膠原Ⅳ、纖維連接蛋白的蛋白表達。 研究結(jié)果： 阿托伐他汀對博萊霉素致大鼠肺纖維化有一定的保護作用，各治療組的肺間質(zhì)纖維化程度較相應(yīng)的BLM組均有減少，其中A4組(0.50±0.32)較M4組(0.81±0.25)、A6組(0.19±0.24)較M6組(0.76±0.18)比較具有顯著性差異(P<0.01)，A2組與M2組比較雖無統(tǒng)計學意義，但仍有減少的趨勢。HE染色、Masson染色顯示：阿托伐他汀各組大

5、鼠肺泡炎及肺纖維化程度較同時期模型組明顯減輕，尤其是6周治療組，肺泡間隔增厚程度明顯減少，雖仍可見成纖維細胞增生，膠原增多，但纖維化面積及病灶明顯縮小。阿托伐他汀對肺纖維化大鼠肺組織羥脯胺酸的影響結(jié)果顯示：從2周開始，BLM組大鼠肺組織HYP就明顯高于對照組，而BLM組之間HYlP的含量有下降的趨勢；阿托伐他汀組則從2周開始低于相應(yīng)的BLM組，HYP呈降低趨勢，表明阿托伐他汀對HYP的合成有一定的的抑制作用。阿托伐他汀對肺纖維化大鼠血氣

6、的影響：BLM各組與對照組比較，PaO<,2>均下降，尤其是2周BLM組，此時模型處于肺泡炎階段。各治療組與同期的BLM組相比，PaO<,2>均有不同程度的升高，盡管仍低于對照組，但隨著治療時間的延長，PaO<,2>越來越接近對照組，說明阿托伐他汀可改善肺纖維化大鼠的氧合功能。BALF中細胞總數(shù)和分類計數(shù)顯示M2、A2組BALF細胞總數(shù)及中性粒細胞有增高趨勢，但統(tǒng)計學無顯著性差異。 Gelatin Zymography明膠酶譜分析BAL

7、F中MMP-9活性顯示：各組BALF均可使明膠底物分解。2周、4周模型組的MMP-9活性均高于對照組(P<0.01)，2周組活性最高。隨著肺纖維化的進程，MMP-9的活性逐漸下降，6周組與對照組相比較無明顯統(tǒng)計學差異。阿托伐他汀處理組的MMP-9活性受到一定程度阻斷，尤其是阿托伐他汀處理的2周組MMP-9活性下降最明顯。而6周組與模型組比較雖有下降的趨勢，但并無統(tǒng)計學意義。EIISA分析。BALF中MMP-9、TIMP-1的濃度顯示：博

8、萊霉素致大鼠肺纖維化的進程中，BALF中的MMP-9的濃度肺泡炎階段(2周)最高(P<0.01)，后逐漸下降，但均高于對照組。而阿托伐他汀各組分泌的MMP-9均有降低，但仍高于對照組。說明阿托伐他汀對肺組織分泌的MMP-9有抑制作用。但血清中的MMP-9模型組及阿托伐他汀組均無明顯統(tǒng)計學差異，故阿托伐他汀對系統(tǒng)分泌的MMP-9無影響。博萊霉素致大鼠肺纖維化的進程中，2～6周內(nèi)BALF中的TMP-1的濃度逐漸升高(P<0.01)。而阿托伐

9、他汀干預(yù)的各組分泌的TIMP-1均有降低。說明阿托伐他汀對肺組織TIMP-1的分泌有抑制作用。但血清中的TIMP-1在模型組及阿托伐他汀組較對照組均無明顯統(tǒng)計學差異，故阿托伐他汀對系統(tǒng)分泌的TlMP-1影響不大。RT-PCR顯示：正常對照組、博萊霉素2周、4周、6周組肺組織勻漿中均有MMP-9、TIMP-1mRNA的表達。與對照組比較，模型組在2周MMP-9、TIMP-1mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著增高，尤以MMP-9增加明顯，在4周、6

10、周時，MMP-9已有所降低，但TIMP-1 mRNA表達仍持續(xù)性增高。與模型組比較，治療組第2周MMP-9、TIMP-1 mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平降低，尤其是MMP-9的表達降低更為明顯，在4周、6周時這種降低作用仍持續(xù)存在。Western blot結(jié)果顯示：正常對照組、博萊霉素2周、4周、6周組肺組織勻漿中均有MMP-9、TIMP-1蛋白的表達。與對照組比較，模型組在2周MMP-9、TIMP-1蛋白表達均顯著增高，在4周時，MMP-9已有

11、所降低，但TIMP-1蛋白表達仍持續(xù)性增高，直至第6周才有下降的趨勢。與模型組比較，各治療組MMP-9、TlMP-1蛋白表達水平均降低。細胞培養(yǎng)MTT顯示：阿托伐具有顯著抑制成纖維細胞增殖的作用，與對照組比較，1μM的阿托伐他汀組的細胞數(shù)降至78.5±8％(P<0.01)，5μM組的細胞數(shù)降至49.8±12.6％(P<0.001)，10μM組的細胞數(shù)降至36.1±10.7％(P<0.001)，0.01μM和0.1μM的阿托伐他汀對細胞的

12、抑制與對照組相比較無顯著的差異，分別為98.3±10.8％(P=0.35) ，92.2±8.4％(P=0.13)。Gelatin Zymography明膠酶譜分析結(jié)果表明：暴露于1μM和5μM的阿托伐他汀72小時的肺成纖維細胞分泌的MMP-9分別減少至(79.11±14.39)％(P=0.1)和(56.74+12.98)％(P<0.01)，而MMP-2分別為(103.90±5.46)％，(79.07±16.75)％；后者雖有下降趨勢但并

13、無統(tǒng)計學意義。Western blot分析細胞培養(yǎng)液中MMP-9、TIMP-1酶活性示：暴露于1μM和5μM的阿托伐他汀72小時的肺成纖細胞分泌的MMP-9分別減少至(84.67±11.74)％(P=0.31)和(29.15±6.03)％(P<0.05)。TIMP-1分別減少至(48.89±1.92)％(P<0.01)和(30.37±2.80)％(P<0.001)。 Westemblot顯示暴露于1μM和5μM的阿托伐他汀72小時的肺成

14、纖細胞分泌的膠原Ⅳ分別減少至65.9±9.32(P<0.05)、42.6±8.5％(P<0.01)。與之類似，暴露于5μM的阿托伐他汀72小時的肺成纖細胞分泌的纖維連接蛋白減少至對照組的20.6±4.2％(P<0.01)。[<'3>H]-脯氨酸滲入結(jié)果顯示：1μM的阿托伐他汀減少脯氨酸的結(jié)合至77.1±15.0％(P<0.05)，5μM的阿托伐他汀減少至54.7±6.6％(P<0.05)。RT-PCR分析阿托伐他汀對成纖維細胞的MMP-

15、9、TIMP-1的mRNA表達的影響結(jié)果顯示，不同濃度的阿托伐他汀處理肺纖維化成纖維細胞72h后MMP-9、TIMP-1 mRNA表達均減少(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1．阿托伐他汀可減輕博萊霉素所致大鼠的肺纖維化。 2．阿托伐他汀抑制博萊霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織的MMP-9、TIMP-1的合成及分泌。 3．阿托伐他汀具有抑制博萊霉素誘導大鼠肺成纖維細胞增殖的作用，并能抑制成纖維細胞分泌的MMP-