融合蛋白TAP-SSL5對(duì)血小板和粒細(xì)胞相互作用的影響.pdf

1、研究背景及目的:
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心腦血管疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。P-選擇素糖蛋白配體-1(P-selectinglycoproteinligand-1,PSGL-1)廣泛存在于單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面。PSGL-1可與激活的血小板或內(nèi)皮表面的P-/E-選擇素結(jié)合,導(dǎo)致粒細(xì)胞在血小板或內(nèi)皮表面的黏附,進(jìn)而激活粒細(xì)胞,誘發(fā)血管壁的炎癥反應(yīng)。金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白-5(staph

2、ylococcalsuperantigen-likeprotein-5,SSL5)可與粒細(xì)胞表面的PSGL-1結(jié)合,抑制粒細(xì)胞在激活內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附;并可通過(guò)與粒細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)結(jié)合,抑制細(xì)胞因子(CCL2/MCP-1、CXCL8/IL-8)和過(guò)敏毒素(C3a、C5a)對(duì)粒細(xì)胞的激活作用。本課題組在前期研究中,SSL5作為引導(dǎo)兼功能分子,與具有抑制凝血因子X(jué)a(FXa)活性的分子—蜱抗凝血肽(tickanticoa

3、gulantpeptide,TAP)進(jìn)行聯(lián)合,構(gòu)建了具有抗炎和抗凝雙效功能的融合蛋白TAP-SSL5。并且體外研究顯示,TAP-SSL5可抑制粒細(xì)胞在P-選擇素表面的黏附,還可直接抑制FXa的活性。本研究通過(guò)探討融合蛋白TAP-SSL5對(duì)“血小板-粒細(xì)胞”聚集體的形成,血小板誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞IL-8蛋白的表達(dá)以及MCP-1誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞遷移的影響,以進(jìn)一步探討TAP-SSL5發(fā)揮抗炎作用的可能機(jī)制。
　　研究方法:
　

4、　1.采用CCK-8試劑盒檢測(cè)TAP-SSL5對(duì)細(xì)胞活力的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)THP-1細(xì)胞表面CD162(PSGL-1)的表達(dá),及TAP-SSL5對(duì)小鼠抗人CD162單抗KPL-1與THP-1細(xì)胞結(jié)合的抑制作用。取健康成人富含血小板血漿(platelet-richplasma,PRP)(取自西南醫(yī)院輸血科),以CGS緩沖液離心洗滌血小板;TAP-SSL5預(yù)處理THP-1或人中性粒細(xì)胞與20μmol/LADP激活的血小板按1:50數(shù)量比

5、共孵育5min后,以anti-CD62P單抗標(biāo)記血小板表面的P-選擇素;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板與THP-1或人中性粒細(xì)胞的結(jié)合情況;并進(jìn)一步采用瑞氏-姬姆薩染色檢測(cè)血小板與人中性粒細(xì)胞的結(jié)合情況以及TAP-SSL5的干預(yù)作用。
　　2.TAP-SSL5預(yù)處理的THP-1細(xì)胞與20mg/LTRAP-6(凝血酶受體激活肽6)激活的血小板1:100數(shù)量比共孵育18h;ELISA試劑盒檢測(cè)上清中IL-8蛋白表達(dá)情況。采用Transwel

6、l小室檢測(cè)TAP-SSL5對(duì)MCP-1誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞遷移的影響。
　　結(jié)果:
　　1.TAP-SSL5濃度在30mg/L或以下時(shí)對(duì)THP-1細(xì)胞或中性粒細(xì)胞的活力無(wú)明顯影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,THP-1細(xì)胞表面有豐富的PSGL-1表達(dá),KPL-1的結(jié)合陽(yáng)性率為90％;TAP-SSL5(終濃度10mg/L)能顯著抑制KPL-1與THP-1細(xì)胞的結(jié)合。20μmol/LADP激活的血小板與THP-1或中性粒細(xì)胞的結(jié)合率分別為

7、(31.3±8.4)%和(35.6±5.9)%;細(xì)胞經(jīng)10mg/LTAP-SSL5預(yù)先處理后,其結(jié)合率分別降至(13.4±6.7)%和(10.4±6.4)%(p<0.01)。瑞氏-姬姆薩染色的結(jié)果顯示:每100個(gè)中性粒細(xì)胞所結(jié)合的血小板數(shù)量為(364.3±79.1)個(gè);細(xì)胞經(jīng)終濃度為10mg/LTAP-SSL5預(yù)先處理中性粒細(xì)胞后,細(xì)胞所結(jié)合的血小板數(shù)量減少至(189.3±53.9)個(gè);TAP-SSL5可抑制激活血小板與中性粒細(xì)胞的結(jié)合

8、(p<0.05)。
　　2.ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示:THP-1+PLT組(陽(yáng)性對(duì)照組)和TAP-SSL5干預(yù)組上清中IL-8蛋白濃度分別為(1068.3±410.7)pg/mL和(737.2±167.4)pg/mL;TAP-SSL5可顯著抑制血小板誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞IL-8蛋白的表達(dá)(p<0.05)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:按遷移細(xì)胞數(shù)相對(duì)于陰性對(duì)照組的倍數(shù)計(jì)算,MCP-1組(陽(yáng)性對(duì)照組)、TAP-SSL5組和SSL5組分別為(14