融合蛋白TAP-SSL5對(duì)動(dòng)脈血栓形成及內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生的影響.pdf

1、研究背景:
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病，發(fā)生在AS不穩(wěn)定斑塊基礎(chǔ)上的急性血栓形成是導(dǎo)致心血管急癥的主要原因。同時(shí)，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)后的血管再狹窄和血栓形成是嚴(yán)重影響患者預(yù)后的主要并發(fā)癥。PCI時(shí)由于內(nèi)皮被剝脫、管壁受損傷，導(dǎo)致凝血反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)，血小板及白細(xì)胞募集到局部并釋放大量細(xì)胞因子和生長(zhǎng)

2、因子，引起平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖，出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和血管重塑，終致新生內(nèi)膜形成和管腔狹窄。白細(xì)胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）可與激活的血小板或內(nèi)皮細(xì)胞表面的P-/E-選擇素結(jié)合，從而導(dǎo)致血小板-白細(xì)胞聚集體形成，及白細(xì)胞在損傷血管處的粘附和浸潤(rùn)。前期研究中，我們已將能夠同PSGL-1結(jié)合的金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白-5(staphylococcal

3、superantigen like protein-5，SSL5)與凝血因子X(jué)a(FXa)的強(qiáng)效抑制劑蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide，TAP)聯(lián)合，構(gòu)建了重組融合蛋白TAP-SSL5。它可與PSGL-1有效結(jié)合，并可顯著抑制血漿FXa活性，從而具有抗炎抗凝雙重作用。本課題在前期研究基礎(chǔ)上，采用雙光子顯微鏡，研究TAP-SSL5對(duì)氯化鐵誘導(dǎo)的小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成的影響;采用流式細(xì)胞術(shù)，研究TAP-SSL

4、5對(duì)血小板-淋巴細(xì)胞結(jié)合的影響;并構(gòu)建巴馬小型豬頸動(dòng)脈球囊損傷模型，初步評(píng)價(jià)TAP-SSL5對(duì)動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生的作用;旨在進(jìn)一步研究融合蛋白TAP-SSL5的功能。
　　研究方法:
　　1.融合蛋白TAP-SSL5對(duì)小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成的影響:采用C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為PBS對(duì)照組、SSL5組(1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg)、T175P組（SSL5無(wú)功能突變體）、TAP組及TAP-SSL5組(1

5、mg/kg、3mg/kg、10mg/kg)(n=3-5)，經(jīng)尾靜脈一次注射PBS或上述重組蛋白。用10％ FeCl3誘導(dǎo)小鼠腸系膜動(dòng)脈損傷，在雙光子顯微鏡下連續(xù)觀測(cè)，以血管損傷至管腔閉塞的時(shí)間(occlusion time，OT)反映血栓形成時(shí)間，OT越長(zhǎng)說(shuō)明藥物的抗血栓作用越強(qiáng)。
　　2.融合蛋白TAP-SSL5對(duì)激活的血小板與淋巴細(xì)胞結(jié)合的影響:采用免疫磁珠分選法分離人外周血淋巴細(xì)胞;CCK8法檢測(cè)重組蛋白對(duì)細(xì)胞活力的影響;以

6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Jurkat細(xì)胞表面PSGL-1的表達(dá)，及TAP-SSL5對(duì)KPL-1與PSGL-1結(jié)合的影響;以20μmol/L的ADP激活血小板，流式細(xì)胞儀檢測(cè)TAP-SSL5對(duì)激活血小板與Jurkat細(xì)胞或人外周血淋巴細(xì)胞結(jié)合的影響。
　　3.融合蛋白TAP-SSL5對(duì)小型豬頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生的影響:以PTCA球囊擴(kuò)張的方法構(gòu)建巴馬小型豬頸動(dòng)脈球囊損傷模型;分為3組初步觀察重組蛋白對(duì)小型豬頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜形成的作

7、用，分別為生理鹽水對(duì)照組、1mg/kg TAP-SSL5組、1 mg/kg SSL5組，耳靜脈注射給藥，1次/周。損傷后28天，取頸動(dòng)脈及主要臟器切片行HE染色，采用Image Pro Plus6.0軟件檢測(cè)最大內(nèi)膜厚度、新生內(nèi)膜和中膜面積，計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比。
　　結(jié)果:
　　1.在PBS對(duì)照組、T175P組小鼠腸系膜動(dòng)脈損傷后閉塞時(shí)間(OT)分別為12.14±0.82min、13.06±0.42min;給予小鼠2 mg

8、/kg TAP靜脈注射后，其OT為19.70±0.84min;在10 mg/kg SSL5組OT為29.75±4.19min;在10 mg/kg TAP-SSL5組OT延長(zhǎng)至38.73±2.21min（與PBS對(duì)照組相比，P＜0.01，與TAP組、10 mg/kg SSL5組相比，P＜0.05; n=3-5）。
　　2.30 mg/L及以下濃度的TAP-SSL5和10 mg/L的SSL5對(duì)Jurkat細(xì)胞活力無(wú)明顯影響;10 mg

9、/L的TAP-SSL5能夠明顯抑制KPL-1與Jurkat細(xì)胞的結(jié)合;ADP激活的血小板與Jurkat細(xì)胞結(jié)合率為(11.86±4.49)％，細(xì)胞經(jīng)10 mg/L TAP-SSL5預(yù)先處理后，結(jié)合率降至(6.73±2.71)％(P＜0.05);ADP激活的血小板與人外周血淋巴細(xì)胞結(jié)合率為(8.32±1.00)％，細(xì)胞經(jīng)10 mg/L TAP-SSL5預(yù)先處理后，結(jié)合率降至（5.51±0.70）％（P＜0.05)。
　　3.給予巴馬

10、小型豬頸動(dòng)脈直徑1.4倍的PTCA球囊擴(kuò)張，在術(shù)后28d可誘導(dǎo)出顯著的新生內(nèi)膜形成;初步結(jié)果顯示，1 mg/kg TAP-SSL5可抑制小型豬頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜形成，且對(duì)小型豬心臟、肝臟、肺、腎臟等主要臟器組織病理無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:
　　融合蛋白TAP-SSL5顯著延長(zhǎng)小鼠腸系膜動(dòng)脈損傷后管腔閉塞時(shí)間，表明其可抑制小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓的形成;TAP-SSL5可與淋巴細(xì)胞表面的PSGL-1結(jié)合，進(jìn)而抑制ADP激活的血