炎癥微環(huán)境響應性納米藥物抑制血管內皮損傷后內膜增生的實驗研究.pdf

1、背景:冠狀動脈疾?。–oronary artery disease，CAD）是導致人類疾病性死亡的主要原因，僅在2013年就導致全球約814萬人死亡。在大多數情況下，動脈粥樣硬化作為一種慢性血管炎癥是導致心血管疾病的最主要的病因。經皮冠狀動脈介入手術（Percutaneous coronary intervention，PCI）包括球囊擴張血管成形術，斑塊旋切術及支架植入術等，是治療CAD（急性心肌梗死和急性冠脈綜合征等）常用的非外科手

2、術治療方式。PCI術中對內皮的機械損傷導致血管內皮損傷局部血栓形成及血管新生內膜過度增生，進而發(fā)生血管再狹窄，是導致手術失敗需要二次 PCI的主要病因。PCI術后局部血管炎癥反應在血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展過程中起了關鍵作用，PCI術中對內皮的損傷或者剝脫，使血小板迅速聚集在受損局部，除了導致血栓形成以外，血小板激活后通過血小板表面受體募集血液循環(huán)中的白細胞，隨即白細胞、激活的血小板及炎性內皮釋放包括腫瘤因子壞死-α（Tumor necros

3、is factor-α，TNF-α），血小板源生長因子（Platelet-derived growth factor，PDGF），堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF），白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等一系列促炎癥因子，誘導血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和遷移，促進細胞外基質合成，最終形成新生內

4、膜，導致血管再狹窄的發(fā)生。
　　針對血管再狹窄的病理生理特性，目前已研發(fā)出多種藥物，包括抗凝藥物、抗炎藥物、抗細胞增殖藥物和抗血小板藥物。其中很多藥物屬于系統(tǒng)性給藥，血管內皮損傷局部藥物濃度較低，為了提高藥物在損傷部位的濃度往往需要提高給藥劑量，導致藥物副作用的發(fā)生，比如抗血小板及抗凝藥物導致的出血不良反應等。藥物洗脫支架雖然明顯降低了血管再狹窄發(fā)生率，但是支架涂層藥物因其沒有選擇性往往會導致再內皮化延遲，需要長期雙抗血小板治療（

5、Double anti-platelet therapy，DAPT），另外支架作為一種異物長期存也會刺激血管產生局部炎癥反應，導致有約5-10％的病人仍會發(fā)生血管再狹窄。
　　最近大量研究表明，納米醫(yī)學在炎癥相關疾病包括心血管疾病的診斷和治療上取得了一些極具應用前景的進展。血管內皮損傷局部存在著過量的活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS），在PCI術后血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。另一方面，血

6、管內皮損傷局部的炎癥反應存在著微酸性環(huán)境。針對上述問題，本研究設想構建炎癥微環(huán)境響應性納米藥物來預防血管再狹窄的發(fā)生。為此，我們基于β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）設計合成酸響應性載體材料（Ac-bCD）和ROS響應性載體材料（Ox-bCD），以抗VSMCs增殖的藥物RAP作為包載藥物，制備相應載藥納米粒，通過體內外實驗評價其預防血管內皮損傷后內膜增生的效果。
　　內容:
　　1．炎癥微環(huán)境響應性β-CD

7、材料的合成
　　1.1 酸響應性材料縮醛化β-CD（Ac-bCD）的合成
　　1gβ-CD和160mg吡啶對甲苯磺酸鹽（PTS）加入至8 mL無水二甲基亞砜（DMSO）中，磁力攪拌下充分溶解后，加入4.5 mL的催化劑2-乙氧基丙烯（EP）。3 h后，加入三乙胺終止反應。產物加入去離子水徹底洗滌沉淀離心后凍干即得。
　　1.2 ROS響應性環(huán)糊精材料（Ox-bCD）的合成
　　2g4-羥甲基苯硼酸頻哪醇酯（PBA

8、P）溶解在12mL無水二氯甲烷中，加入2.8g1,1’-羰基二咪唑（CDI）室溫活化PBAP。室溫反應30min后，加入14mL的二氯甲烷，去離子水徹底清洗三次。收集的有機相用飽和氯化鈉溶液清洗三遍，無水硫酸鈉干燥1h即獲得CDI活化的PBAP。之后，1.5g CDI活化的PBAP與250mgβ-CD溶解在20mL無水DMSO中，將0.8g的4-二甲基吡啶（DMAP）加入至上述溶液中，室溫條件下磁力攪拌12h。最終產品用去離子水沉淀離心

9、后徹底洗滌三次凍干獲取。
　　材料經傅里葉轉換紅外光譜（FT-IR）和1H核磁共振譜（NMR）進行結構分析及驗證。
　　2．載雷帕霉素納米粒的制備
　　采用改進的納米沉淀-自組裝法制備載雷帕霉素（RAP）納米粒。具體過程為，精確稱取50mg Ac-bCD或者PLGA材料和10mg RAP溶解在2mL乙腈（Ox-bCD載體材料用甲醇作為有機溶劑溶解）中得到油相，卵磷脂乙醇溶液（4mg，0.4mL）和DSPE-PEG200

10、0（6mg）溶解在9.6mL的去離子水中得到水相。水相在65℃油浴條件下加熱0.5h后，將油相以1mL/min的速度逐滴加入至水相中。室溫條件下攪拌反應2h揮發(fā)有機溶劑，以16000rpm的速度離心并使用去離子水洗三次分別獲得載雷帕霉素PLGA（RAP/PLGA），Ac-bCD（RAP/Ac-bCD）及Ox-bCD（RAP/Ox-bCD）納米粒。Cy5或Cy7.5標記的相應納米粒由同樣的方法制備。
　　3．納米粒的理化性質表征

11、r>　　納米粒的粒徑分布、大小及Zeta電位由馬爾文粒徑儀測定。將制備的納米粒溶液滴至銅網膜上，室溫揮干后表面形態(tài)由透射電子顯微鏡（TEM）觀察并采集圖像。載RAP納米粒由乙腈/甲醇混合溶液溶解破乳后，載藥量由高效液相色譜法（HPLC）測定。Cy5或Cy7.5含量由熒光光譜儀測定。
　　4．空白納米粒體外水解實驗
　　空白Ac-bCD納米粒分別分散于pH5.0或7.4的PBS緩沖液中?？瞻譕x-bCD納米粒分散于濃度梯度的H

12、2O2/PBS緩沖液中。于不同時間點采集樣品采用紫外-可見分光光度計測量500nm處的透光率?？瞻譖LGA納米粒作為非響應性載體材料對照以同樣的方法測定相應透光率。以透光率數據計算相應納米粒水解的程度。
　　5．載雷帕霉素納米粒的體外藥物釋放實驗
　　RAP/Ac-bCD納米粒分別分散于8mL pH值5.0或7.4的PBS緩沖液中，RAP/Ox-bCD納米粒則分散于8mL含或不含1mM H2O2的PBS緩沖液中。于不同時間點

13、采集樣品并補充相應量溶液，HPLC測定藥物濃度，繪制不同納米粒藥物釋放曲線。同樣的方法以RAP/PLGA納米粒作非響應性載體材料對照繪制相應藥物累計釋放曲線。
　　6．納米粒的細胞吞噬實驗
　　SD大鼠（180-200g）安樂死后取胸主動脈，大鼠原代血管平滑肌細胞（rVSMCs）由組織塊貼壁法分離并培養(yǎng)。第3-6代的rVSMCs用于后續(xù)實驗。rVSMCs以3×105個/孔的密度接種于6孔板中。孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入不同濃度

14、梯度的Cy5標記納米粒與細胞共孵育，另取同一濃度的納米粒與細胞孵育不同時間，溶酶體熒光標志物（lyso-tracker green）染色標記晚期核內體/溶酶體，DAPI染核，激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察采集圖像。另采用流式細胞術（FACS）進一步定量分析細胞吞噬納米粒量。
　　7．載雷帕霉素納米?？箁VSMCs遷移的作用研究
　　采用Transwell小室檢測RAP不同制劑對血小板源性生長因子BB（PDGF-BB）誘導的

15、rVSMCs遷移的影響。rVSMCs以2×105個/孔的密度接種于12孔板。孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后改為含有0.5%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入PDGF-BB（20ng/mL）及RAP終濃度為1μM的不同RAP制劑（RAP原料藥，RAP/PLGA NP，RAP/Ac-bCD NP，RAP/Ox-bCD NP）。6h后胰酶消化收集細胞加至Transwell小室上層，下層加入PDGF-BB（20ng/mL），分別設置陰性及陽性對

16、照。孵箱靜置8h待上室細胞往下室遷移，棉簽輕輕擦去上室細胞，遷移至Transwell小室下層的細胞用0.3%結晶紫染色。光學顯微鏡高倍條件拍照計數并進行統(tǒng)計學比較。
　　8．載雷帕霉素納米?？箁VSMCs增殖的作用研究
　　rVSMCs以5000個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后改為含有0.5% FBS的DMEM培養(yǎng)基，加入PDGF-BB（20ng/mL）及RAP終濃度為1μM的不同RAP制劑（RAP原料藥

17、，RAP/PLGA NP，RAP/Ac-bCD NP，RAP/Ox-bCD NP），分別設置陰性及陽性對照。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，CCK-8法檢測細胞的活力。
　　9．空白納米粒的細胞毒性實驗研究
　　rVSMCs以1×104個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，24h后加入濃度梯度的空白納米粒（PLGA NP，Ac-bCD NP，Ox-bCD NP），繼續(xù)培養(yǎng)24h后CCK-8法檢測細胞的生存能力。
　　10．載體材料空白納米

18、粒的體內急性毒性評價
　　雄性SD大鼠（180-200g）隨機分成4組（n=3）。大鼠采用尾靜脈注射的方式分別注射500mg/kg的PLGA NP、Ac-bCD NP或Ox-bCD NP，對照組大鼠尾靜脈注射生理鹽水，監(jiān)測大鼠體重及其活動行為。于給藥后第14d對大鼠實施安樂死，收集血液樣本進行血液指標分析，主要器官稱重計算臟器指數并行蘇木精-易紅（H&E）染色觀察其病理變化。另體外溶血試驗檢測納米粒的安全性，采集大鼠血液制備2%紅

19、細胞懸液，與不同濃度梯度的PLGA NP、Ac-bCD NP或Ox-bCD NP共孵育2h后，離心測上清中血紅蛋白濃度。
　　11．大鼠頸動脈球囊損傷模型的建立及損傷部位ROS水平的檢測
　　雄性SD大鼠麻醉后，脫毛膏去除頸部毛發(fā)，頸部消毒后正中切口暴露頸總、頸內及頸外動脈，Edwards2F取栓導管球囊經由頸外動脈切口插入頸總動脈，充盈球囊至適當阻力，旋轉拖拉球囊三次徹底去除頸總動脈血管內皮，尾靜脈注射伊文思藍溶液檢測內皮

20、損傷情況，模型建立后14d后取材切片HE染色觀察內膜增生情況。成功建立大鼠頸動脈損傷模型之后，取材行DHE染色檢測局部超氧陰離子表達水平，并通過試劑盒檢測損傷局部過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）水平。
　　12．納米粒靶向于血管內皮損傷部位的研究
　　大鼠頸動脈球囊損傷后，經尾靜脈即刻分別注射Cy7.5標記的三種熒光納米粒（Cy7.5/PLGA NP，Cy7.5/Ac-bCD NP，Cy7.5/Ox-bCD NP），體

21、內循環(huán)8h后，取損傷段頸動脈及主要臟器行小動物熒光成像（IVIS）觀察其在血管內皮損傷部位靶向情況及組織分布。另外，頸動脈球囊損傷后，經尾靜脈注射Cy7.5/Ac-bCD納米粒于不同時間點取損傷段頸動脈成像觀察分析靶向情況和滯留時間。
　　13．載雷帕霉素納米粒抑制大鼠頸動脈內皮損傷后新生內膜形成的研究
　　雄性SD大鼠隨機分成六組（n=5）：假手術組，生理鹽水治療組，RAP原料藥組，RAP/PLGA納米粒組，RAP/Ac-

22、bCD納米粒組，RAP/Ox-bCD納米粒組。頸動脈損傷模型制備成功后，分別于損傷后立即（0d），3d，7d，11d尾靜脈注射RAP終濃度為1mg/kg的不同RAP制劑。第14大鼠行安樂死，灌注后取損傷段血管，切片后HE染色觀察內膜增生情況，免疫組織化學分析檢測相關標志物表達水平。
　　研究結果:
　　1.炎癥響應性材料及納米粒的合成和制備
　　以β-CD為原料，采取一步法縮醛反應合成了酸響應性材料Ac-bCD，FT-

23、IR和1H NMR證實合成成功。ROS響應性材料Ox-bCD則是通過在β-CD上鍵合氧化敏感響應性基團PBAP得到，FT-IR和1H NMR證實合成成功，根據1H NMR結果積分計算表明每個β-CD分子上結合有7個單位的PBAP。以非響應性載體材料PLGA為對照，采用納米沉淀-自組裝法成功制備了三種材料的載RAP納米粒，透射電鏡觀察示，納米粒呈球形，形態(tài)規(guī)則，粒徑分布均一。馬爾文粒徑儀測定納米粒粒徑示RAP/PLGA納米粒、RAP/Ac

24、-bCD納米粒和RAP/Ox-bCD納米粒的粒徑分別約為215、238和212nm。
　　2．納米粒的體外水解和藥物釋放實驗
　　相比在PBS（pH7.4）下，Ac-bCD納米粒在pH5.0的PBS中水解迅速，藥物釋放快速，具有良好的酸響應性。相比PBS（pH7.4）條件下，Ox-bCD納米粒水解和藥物釋放與H2O2密切相關，在H2O2存在條件下，材料快速水解，藥物釋放迅速，具有良好的氧化響應性。PLGA納米粒在微酸環(huán)境和H

25、2O2環(huán)境下的水解與其在PBS（pH7.4）中的水解和藥物釋放。
　　3．納米粒的細胞吞噬實驗
　　激光共聚焦及流式細胞術定量分析示，rVSMCs可實現對納米粒的吞噬，且呈時間和濃度依賴性，細胞納米粒吞噬過程主要由胞內內涵體/溶酶體介導。
　　4．雷帕霉素不同制劑抗血管平滑肌細胞增殖和遷移作用的比較
　　載RAP納米制劑較RAP原料藥能更明顯的抑制PDGF-BB誘導的rVSMCs的增殖和遷移，并且載RAP不同納米

26、粒之間比較，載RAP響應性納米粒抑制rVSMCs增殖和遷移能力的效果最顯著。
　　5．大鼠頸動脈球囊損傷部位的ROS水平
　　伊文思藍染色及HE染色示，大鼠頸動脈球囊損傷部位血管成功去內皮化，新生內膜形成明顯。與正常血管相比，頸動脈內皮損傷部位DHE染色顯示超氧陰離子水平明顯升高，損傷部位H2O2和MDA水平顯著升高，提示ROS與內膜增生密切相關。
　　6．三種載體材料納米粒對大鼠頸動脈內皮損傷部位的靶向情況
　

27、　與正常血管相比較，Cy7.5標記的三種不同載體材料構建的納米粒均可以在大鼠頸動脈損傷段明顯靶向和聚集，且可以滯留較長時間。
　　7．雷帕霉素不同制劑抑制頸動脈內皮損傷后內膜增生的藥效研究
　　載RAP納米制劑較RAP原料藥能更有效的抑制內膜增生的程度。另外載RAP不同納米粒之間比較提示，載 RAP響應性納米粒組較PLGA納米粒組抑制內膜增生的的效果更顯著。免疫組織化學染色結果表明載RAP炎癥微環(huán)境響應性納米粒組SMα-ac

28、tin陽性細胞數目和PCNA陽性細胞數最少，MMP-9的表達顯著下降。
　　8．響應性納米材料的初步安全性評價
　　三種材料構建的空白納米粒對rVSMCs活力基本影響。三種材料構建的空白納米粒與血液樣本共孵育未見明顯溶血現象發(fā)生。大鼠體內急性毒性評價提示，尾靜脈注射500mg/kg響應性空白納米粒后14d，未見明顯動物行為異常，體重，臟器指數，血常規(guī)，血生化指標（肝腎功標志物）與生理鹽水對照組相比無明顯差異，主要臟器HE染色

29、未見明顯病理學改變。提示響應性納米材料體內安全性良好。
　　研究結論:
　　1.基于β-環(huán)糊精成功合成酸響應性的Ac-bCD材料和ROS響應性的Ox-bCD材料，并成功制備了相應載RAP納米粒。
　　2.不同載體材料構建的納米粒均能被rVSMCs有效吞噬。載RAP炎癥微環(huán)境響應性納米粒能夠顯著抑制PDGF-BB誘導的rVSMCs增殖和遷移
　　3.構建的炎癥微環(huán)境響應性納米粒可靶向聚集于大鼠頸動脈球囊損傷部位。<