人胚胎主動(dòng)脈血管內(nèi)皮前體細(xì)胞移植修復(fù)血管內(nèi)皮損傷的初步研究.pdf

1、研究目的:
　　目前，經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)(percutaneous transluminal angioplasty，PTA)已經(jīng)被普遍應(yīng)用于臨床，成為心血管疾病診治的重要手段。與傳統(tǒng)意義上的外科手術(shù)相比，PTA減少了手術(shù)創(chuàng)傷，降低了手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，具有簡捷和微創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)，獲得了令人滿意的療效。然而，在進(jìn)行PTA時(shí)，不可避免地會(huì)損傷血管內(nèi)皮，術(shù)后必然會(huì)引起一系列的修復(fù)反應(yīng)。PTA術(shù)后管壁新生內(nèi)膜的過度增生將會(huì)導(dǎo)致原手術(shù)段發(fā)生再狹窄。再狹窄

2、是PTA術(shù)后最大的并發(fā)癥，將再次危及患者的健康和生命。因此，PTA術(shù)后如何防治再狹窄成為當(dāng)前外科領(lǐng)域亟待解決的難題之一。
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致再狹窄發(fā)生的始動(dòng)因素。手術(shù)損傷及血流動(dòng)力學(xué)改變導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞變性和剝脫，內(nèi)膜下的基質(zhì)暴露于血液，引起血小板聚集于該處。血小板釋放有絲分裂原，可以趨化血小板和粒細(xì)胞聚集，還可以刺激血管中膜的平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、分泌以及血管壁結(jié)構(gòu)的重塑。與此同時(shí)，血管內(nèi)膜完整性的破壞會(huì)導(dǎo)致其自身分泌的血管

3、保護(hù)性介質(zhì)減少，而血管收縮性介質(zhì)及促生長物質(zhì)的分泌會(huì)增多。各種因素相互作用共同促進(jìn)了再狹窄的發(fā)生。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞成為PTA術(shù)后防治再狹窄的靶點(diǎn)之一。保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，恢復(fù)血管內(nèi)皮功能成為關(guān)鍵策略之一。
　　血管內(nèi)皮前體細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)屬于干細(xì)胞群體，來源于骨髓，動(dòng)員后可進(jìn)入外周血循環(huán)，募集到血管損傷部位，增殖并分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而替代受損傷的血管

4、內(nèi)皮。大量研究表明，在修復(fù)血管內(nèi)皮損傷和血管新生中EPCs都扮演著極其重要的角色。
　　在本研究中，我們應(yīng)用球囊導(dǎo)管損傷大鼠頸總動(dòng)脈來建立急性血管內(nèi)皮損傷模型，然后將人胚胎主動(dòng)脈來源的EPCs局部注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷的頸動(dòng)脈管腔內(nèi)，觀察EPCs是否可以介導(dǎo)損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)，抑制新生內(nèi)膜的增生。我們的研究旨在為人胚胎來源EPCs的臨床應(yīng)用提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:
　　1、建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型。通過蘇木素-伊

5、紅染色(hematoxylin-eosin，HE)明確頸動(dòng)脈球囊損傷模型構(gòu)建成功，利用伊文氏藍(lán)(Evans blue)染色觀察頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷情況。
　　2、球囊損傷頸動(dòng)脈后，將BCECF-AM熒光染料標(biāo)記的EPCs局部注入損傷的頸動(dòng)脈段管腔內(nèi)，24小時(shí)后處死大鼠，獲取損傷部位的頸動(dòng)脈，體視熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記有綠色熒光的EPCs在頸動(dòng)脈內(nèi)膜表面的分布情況。
　　3、將大鼠隨機(jī)分為兩組:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各10只。行球囊損傷

6、頸動(dòng)脈后，實(shí)驗(yàn)組局部注入40μl含1×106 EPCs的細(xì)胞懸液，對(duì)照組則局部注入等量生理鹽水，30分鐘后恢復(fù)頸動(dòng)脈血流，關(guān)閉頸部切口。
　　4、術(shù)后2周、4周各處死實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組5只大鼠，獲取損傷側(cè)頸總動(dòng)脈近分叉部分，約1cm長度，HE染色評(píng)估EPCs移植對(duì)頸動(dòng)脈損傷后新生內(nèi)膜增生的影響，人vWF、CD31及線粒體免疫組織化學(xué)染色分析人源性EPCs移植后的存活及分化情況。
　　研究結(jié)果:
　　1、HE染色證實(shí)大鼠頸動(dòng)

7、脈球囊損傷模型成功建立。顯微鏡下觀察可見:健側(cè)頸總動(dòng)脈內(nèi)膜覆蓋著一層完整的血管內(nèi)皮，可見內(nèi)膜表面存在藍(lán)染的細(xì)胞核，而損傷側(cè)的頸總動(dòng)脈可見內(nèi)膜層缺失，無單層內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋。通過Evans blue染色觀察大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷情況，可見:健側(cè)頸總動(dòng)脈由于血管內(nèi)皮細(xì)胞單層存在未被染色，而損傷側(cè)的頸總動(dòng)脈基本上被染成藍(lán)色，提示血管內(nèi)皮剝脫。
　　2、BCECF-AM熒光染料標(biāo)記的EPCs移植后24小時(shí)，體視熒光顯微鏡下觀察到血管內(nèi)膜損傷處有散

8、在的綠色熒光表達(dá)，表明EPCs移植后可以粘附到血管損傷內(nèi)膜表面并存活下來。
　　3、在球囊損傷頸動(dòng)脈后2周和4周，HE染色可見:無論實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組的頸動(dòng)脈均表現(xiàn)為內(nèi)膜增生、紊亂，管腔縮小。然而，實(shí)驗(yàn)組的血管內(nèi)膜面積（IA）和內(nèi)膜/中膜面積比值(I/M)均明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，表明EPCs移植抑制了大鼠頸動(dòng)脈損傷后血管新生內(nèi)膜的增生。而免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)人vWF在實(shí)驗(yàn)組血管內(nèi)膜表面呈陽性表達(dá)，進(jìn)一步提示EPCs移植介導(dǎo)

9、了損傷血管的再內(nèi)皮化。
　　4、免疫組織化學(xué)染色可見實(shí)驗(yàn)組頸動(dòng)脈內(nèi)膜表面人CD31及線粒體呈陽性表達(dá)，而對(duì)照組的血管內(nèi)膜表面無陽性表達(dá)，這表明人胚胎主動(dòng)脈EPCs移植后能夠粘附于損傷的血管內(nèi)膜，存活并能分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成完整的血管內(nèi)皮。
　　研究結(jié)論:
　　人胚胎主動(dòng)脈來源的EPCs移植至血管損傷部位后，可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，有效抑制血管新生內(nèi)膜增生，修復(fù)血管內(nèi)皮損傷，可以用作治療PTA術(shù)后再狹窄的細(xì)胞材料