辛伐他汀抑制損傷血管新生內(nèi)膜過度增生及促進(jìn)再內(nèi)皮化的研究.pdf

1、研究背景 內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能不全是血管損傷后有害修復(fù)、動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素和根本原因，平滑肌細(xì)胞增生遷移是其繼發(fā)因素和外在表現(xiàn)。修復(fù)損傷血管的關(guān)鍵在于抑制平滑肌細(xì)胞過度增生與促進(jìn)損傷內(nèi)皮重建。既往關(guān)于增殖性血管疾病治療的研究熱點(diǎn)主要集中于平滑肌細(xì)胞增生機(jī)制的探討及如何有效抑制平滑肌細(xì)胞過度增生。雷帕霉素和紫杉醇藥物洗脫支架是臨床防治損傷血管過度的有效手段，但往往會干擾內(nèi)皮修復(fù)，引起損傷血管段再內(nèi)皮化不全或延遲及遲發(fā)性支架內(nèi)血栓

2、形成。因此，篩選選擇性抑制新生內(nèi)膜增生不影Ⅱ向甚至損傷血管再內(nèi)皮化的洗脫支架包被藥物是新一代洗脫支架的研制方向。 既往認(rèn)為，參與損傷血管修復(fù)的細(xì)胞成分是血管壁平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。近來研究發(fā)現(xiàn)，骨髓中存在血管祖細(xì)胞——平滑肌祖細(xì)胞(smooth muscle progenitor cells，SPCs)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)。血管損傷后這些細(xì)胞可動(dòng)員入外周血，歸巢于損傷

3、血管段，平滑肌祖細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)新生內(nèi)膜生成，同時(shí)可導(dǎo)致管腔狹窄；內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，重建管腔內(nèi)皮細(xì)胞單層，抑制損傷血管有害重構(gòu)。最近動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均證實(shí)新生內(nèi)膜中約一半以上平滑肌細(xì)胞是骨髓來源的，約25％內(nèi)皮細(xì)胞是內(nèi)皮祖細(xì)胞來源的。說明骨髓源平滑肌祖細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞是參與損傷血管修復(fù)的重要細(xì)胞源。因此，抑制平滑肌祖細(xì)胞增殖可減少血管損傷后新生內(nèi)膜過度增生，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖，有助于損傷血管再內(nèi)皮化，抑制新內(nèi)膜發(fā)展。

4、 他汀類藥物具有良好的調(diào)脂作用，能夠降低低密度脂蛋白膽固醇和升高高密度脂蛋白膽固醇。同時(shí)，在膽固醇水平相當(dāng)?shù)那闆r下，他汀類藥物能顯著降低心血管事件的發(fā)生率。此外，他汀類藥物還具有抑制血小板聚集和血管中膜平滑肌細(xì)胞增殖，改善內(nèi)皮功能，抑制炎癥反應(yīng)及增加斑塊穩(wěn)定性作用。新近研究顯示他汀類藥物能增加內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量、改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能。他汀類藥物的這些生物學(xué)效應(yīng)提示其有可能成為理想的第二代洗脫支架藥物。由于損傷位點(diǎn)有效藥物濃度過低，臨床

5、口服他汀類藥物并不能抑制支架內(nèi)再狹窄。局部用藥有靶區(qū)有效血藥濃度高、作用時(shí)間長和全身毒性低優(yōu)點(diǎn)。尚不清楚局部應(yīng)用他汀類藥物能否有效抑制新生內(nèi)膜增生，同時(shí)加速損傷區(qū)再內(nèi)皮化。 研究目的： 1．觀察臨床廣泛應(yīng)用的洗脫支架包被藥物雷帕霉素對內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞分化、增殖、遷移和黏附的影響；2．觀察辛伐他汀對血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞分化、增殖、遷移和黏附的影響。3．觀察辛伐他汀對平滑肌細(xì)胞表達(dá)平滑肌

6、祖細(xì)胞趨化因子SDF-1α的影響；4．建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，觀察局部應(yīng)用辛伐他汀能否抑制損傷血管新生內(nèi)膜過度增生并促進(jìn)損傷血管再內(nèi)皮化，為應(yīng)用他汀類藥物包被洗脫支架提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1．觀察雷帕霉素對內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞分化、增殖、遷移和黏附的影響：采用密度梯度離心法從大鼠骨髓獲取單個(gè)核細(xì)胞，分別重懸于平滑肌祖細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基中，接種在纖維連接素包被培養(yǎng)板，加入不同濃度雷帕霉素(0，0.01，0.

7、1，1，10，100 ng/ml)，培養(yǎng)12天后，α-SMA和CD34免疫熒光染色鑒定骨髓源性平滑肌祖細(xì)胞，熒光顯微鏡鑒定FITC-UEA-Ⅰ和Di Ⅰ-acLDL雙染陽性細(xì)胞為正在分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞，并在倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。收集原代培養(yǎng)8天貼壁細(xì)胞，分別加入不同濃度雷帕霉素(0，0.1，1，10，100，200 ng/ml)培養(yǎng)0、12、24、48、96 h。然后分別采用MTT比色法、改良的Boyden小室和黏附能力測定實(shí)驗(yàn)觀察內(nèi)皮祖

8、細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞的增殖、遷移和黏附能力。 2．觀察辛伐他汀對血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞分化、增殖、遷移和黏附的影響：分別采用酶消化法和組織塊法分離培養(yǎng)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，加入不同濃度辛伐他汀(0，0.01，0.1，1，10μmol/L)培養(yǎng)0、6、12、24、48 h，然后分別采用<'3>H-TdR摻入法、改良的Boyden小室和黏附能力測定實(shí)驗(yàn)觀察內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移能力。采用前

9、述方法分離培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞，將其接種在纖維連接素包被培養(yǎng)板，加入不同濃度辛伐他汀(0，0.01，0.1，1，10μmol/L)，培養(yǎng)8 d，前述方法鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。收集原代培養(yǎng)8 d的內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞，分別加入不同濃度辛伐他汀(0，0.01，0.1，1，10μmol/L)培養(yǎng)O、6、12、24、48 h。然后分別采用<'3>H-TdR摻入法、改良的Boyden小室和黏附能力測定實(shí)驗(yàn)

10、觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞的增殖、遷移和黏附能力。Western blot檢測不同濃度辛伐他汀(0，0.01，0.1，1，10μmol/L)作用24小時(shí)對內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞周期抑制蛋白P27表達(dá)的影響。 3．觀察辛伐他汀對平滑肌細(xì)胞表達(dá)平滑肌祖細(xì)胞趨化因子SDF-1α的影響：不同濃度辛伐他汀(0，0.01，0.1，1，10μmol/L)干預(yù)平滑肌細(xì)胞24 h，1μmol/L辛伐他汀干預(yù)平滑肌細(xì)胞6

11、～48 h，RT-PCR檢測SDF-1α mRNA表達(dá)。 4．局部應(yīng)用辛伐他汀對損傷血管新生內(nèi)膜過度增生和再內(nèi)皮化影響：建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，將400μg辛伐他汀溶于50μl F-127基質(zhì)膠中，加在頸動(dòng)脈外膜區(qū)域模擬洗脫支架。2周后，處死動(dòng)物，取目標(biāo)血管段，固定，石蠟包埋切片，HE染色觀察新生內(nèi)膜厚度，vWF染色觀察損傷血管再內(nèi)皮化程度。 主要結(jié)果 1．雷帕霉素對內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞分化、增殖、遷移和

12、黏附的影響：成功分離培養(yǎng)骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞vWF染色陽性，UEA-Ⅰ和DiLDL雙染色陽性，可見梭形細(xì)胞首尾相連形成線狀結(jié)構(gòu)。平滑肌祖細(xì)胞α-SMA、CD34染色陽性。雷帕霉素濃度依賴性抑制骨髓單個(gè)核細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞分化。0.1 ng/ml的雷帕霉素作用12天，分化EPC數(shù)量減少59.3±5.8％(n=5，P<0.01)，平滑肌祖細(xì)胞數(shù)量減少70.5±34.5％(n=5，P<0.01)。雷帕霉素濃度

13、和時(shí)間依賴性抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞增殖。1 ng/ml作用24 h顯著抑制EPC (1 ng/ml雷帕霉素組與對照組之比為0.418±0.018 vs 0.580±0.034，n=5，P<0.01)和SPC(1ng/ml雷帕霉素組與對照組之比為0.476±0.016 vs 0.687±0.043，n=5，P<0.01)增殖。1 ng/ml雷帕霉素作用12 h對EPC和SPC增殖無明顯影響(n=5，P>0.05)。0.1 ng/ml

14、雷帕霉素對EPC和SPC增殖影響不明顯(n=5，P>0.05)。雷帕霉素也濃度依賴性抑制EPC和SPC遷移和黏附能力。 2．辛伐他汀對血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞分化、增殖、遷移和黏附的影響：辛伐他汀濃度和時(shí)間依賴性抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。 3．局部應(yīng)用辛伐他汀對大鼠損傷血管新生內(nèi)膜過度增生和再內(nèi)皮化影響：局部應(yīng)用辛伐他汀抑制大鼠損傷頸動(dòng)脈新生內(nèi)皮過度增生，對照組與辛伐他汀組新生內(nèi)膜面積之比為0.

15、58±0.13mm<'2> vs 0.27±0.12 mm<'2>(n=6，P<0.01)，辛伐他汀組內(nèi)膜/中膜比減少(對照組與辛伐他汀組之比為1.95±0.27 vs 0.97±0.24，n=6，P<0.01)。內(nèi)皮細(xì)胞vWF免疫組化染色未觀察到對照組和辛伐他汀組再內(nèi)皮化差異。 全文結(jié)論 1．雷帕霉素時(shí)間和濃度依賴性抑制骨髓源平滑肌祖細(xì)胞分化、增殖、遷移和黏附；雷帕霉素也減少骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和抑制其功能。尋找新的洗

16、脫支架藥物需考慮其對平滑肌祖細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響。 2．辛伐他汀選擇性促進(jìn)骨髓單個(gè)核細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移和黏附，抑制其向平滑肌祖細(xì)胞分化。抑制平滑肌細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞增殖、遷移和黏附，不影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。 3．辛伐他汀濃度和時(shí)間依賴性抑制平滑肌細(xì)胞SDF-1αmRNA表達(dá)，間接抑制平滑肌祖細(xì)胞參與的新生內(nèi)膜增生。 4．局部應(yīng)用辛伐他汀能有效抑制損傷動(dòng)脈新內(nèi)膜過度增生，不影響損傷血