人參皂甙Rg1對(duì)人牙周膜細(xì)胞生物學(xué)活性及大鼠牙周組織相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 1、研究玻片覆蓋法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞的成功率及生物學(xué)性狀；在此基礎(chǔ)上研究人參皂甙Rg1對(duì)原代培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。 2、通過(guò)給Wistar大鼠肌注糖皮質(zhì)激素及牙間結(jié)扎鋼絲建立一種近似人類(lèi)臨床牙周炎的動(dòng)物模型，研究人參皂甙Rg1對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的牙周組織中白介素6(IL-6)、骨鈣素(BGP)表達(dá)的影響。 方法： 1、利用形態(tài)學(xué)、免疫組化方法來(lái)觀察玻片覆蓋法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞

2、的成功率及其生物學(xué)特性，并鑒定其來(lái)源。 2、在體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法、考馬斯亮藍(lán)法、酶動(dòng)力學(xué)方法探討人參皂甙Rg1對(duì)原代培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞增殖活性、蛋白合成、堿性磷酸酶(ALP)活性的影響。 3、采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察人參皂甙Rg1對(duì)體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。 4、體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞經(jīng)鈣熒光指示劑Fluo-3負(fù)載后，用激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定人參皂甙Rg1影響前后的細(xì)胞

3、內(nèi)游離鈣離子濃度隨時(shí)間變化情況。 5、選用100只體重160-200g Wistar大白鼠，隨機(jī)分成10組，每組10只。A組：正常對(duì)照組，于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始(0周)時(shí)處死。B-E組：人參皂甙Rg1治療組。F-J組：牙周炎對(duì)照組。B-E組分別于牙周炎模型建立并給藥后第1、2、3、4周處死，每次一組。F-J組分別于牙周炎模型建立后第0、1、2、3、4周處死，每次一組。切取大鼠上頜磨牙牙周組織標(biāo)本作切片，免疫組織化學(xué)方法對(duì)IL-6、BGP進(jìn)行

4、染色，光鏡觀察，測(cè)量灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1、玻片覆蓋法可顯著提高人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功率。 2、人參皂甙Rg1對(duì)牙周膜細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響 與對(duì)照組相比人參皂甙Rg10.005/μmol/L，0.01/μmol/L，0.05/μmol/L，0.1/μmol/L，1/μmol/L組均能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)，且在0.01-0.05/μmol/L濃度范圍內(nèi)作用時(shí)間最長(zhǎng)。 3、

5、人參皂甙Rg1對(duì)牙周膜細(xì)胞蛋白含量的影響 與對(duì)照組相比人參皂甙Rg10.01μmol/L，0.05μmol/L，0.1μmol/L組72小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中蛋白含量均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。 4、人參皂甙Rg1對(duì)牙周膜細(xì)胞ALP活性的影響： 與對(duì)照組相比人參皂甙Rg10.01μmol/L，0.05μmol/L，0.1μmol/L組72小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中ALP活性均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。 5、人

6、參皂甙Rg1對(duì)牙周膜細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響： 人參皂甙Rg1(0.01μmol/L)使人牙周膜細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子降低，最后維持在比加藥前低的靜息鈣水平上。 6、人參皂甙Rg1對(duì)細(xì)胞周期的影響： FCM檢測(cè)顯示經(jīng)0.01μmol/L人參皂甙Rg1作用48h后，牙周膜細(xì)胞G1期細(xì)胞降低(P<0.05)，S期細(xì)胞升高且細(xì)胞增殖指數(shù)PrI值(S+G2/M)％顯著增高(P<0.05)。 7、大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物

7、模型的成功建立： 動(dòng)物采用牙間結(jié)扎加激素注射第4天后便出現(xiàn)了進(jìn)食減少、倦怠少動(dòng)等表現(xiàn)，符合中醫(yī)腎虛的癥狀，并且出現(xiàn)了牙槽骨疏松、牙槽嵴吸收、牙周袋形成等病理性改變。正常組大鼠則無(wú)上述表觀。牙周炎組牙周組織中BGP表達(dá)明顯低于正常組，IL-6表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05)。 8、人參皂甙Rg1對(duì)大鼠牙周組織中有關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響： 從治療第二周起，治療組較牙周炎對(duì)照組牙周組織中的BGP水平明顯升高(P<0.0

8、5)；治療第三周起，治療組較對(duì)照組牙周組織中的IL-6水平顯著降低(P<0.05)，經(jīng)治療后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全身狀況也顯著改善。 結(jié)論： 玻片覆蓋法可顯著提高人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功率。人參皂甙Rg1在一定濃度范圍內(nèi)能提高牙周膜細(xì)胞的增殖活性、蛋白合成及堿性磷酸酶活性。人參皂甙Rg1使牙周膜細(xì)胞G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增加，細(xì)胞增殖指數(shù)PrI值(S+G2/M)％增高，促進(jìn)更多的細(xì)胞進(jìn)人增殖狀態(tài)，且人參皂甙Rg1可能通過(guò)改變細(xì)

9、胞內(nèi)游離鈣離子的濃度，達(dá)到其促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。牙間結(jié)扎加糖皮質(zhì)激素注射的方法可成功地建立近似于人類(lèi)臨床牙周炎的動(dòng)物模型，為下一步研究中藥防治牙周炎提供了很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型牙周組織中IL-6含量較正常對(duì)照組明顯升高，BGP含量較正常對(duì)照組明顯降低，應(yīng)用人參皂甙Rg1能顯著抑制實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型牙周組織中IL-6的表達(dá)，同時(shí)升高BGP的含量。根據(jù)上述結(jié)果證實(shí)人參皂甙Rg1可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和組織再生，具有治療牙周炎并改善全身狀