AcMNPV凋亡抑制因子Ac-IAP1-2的功能研究.pdf

1、IAPs，統(tǒng)稱為凋亡抑制因子(Inhibitors of apoptosis)，最初在桿狀病毒中作為一類抗凋亡蛋白被發(fā)現(xiàn)，之后在其他物種（如哺乳動(dòng)物，果蠅，線蟲(chóng)等）中也發(fā)現(xiàn)了它們的身影。在桿狀病毒中，IAPs是調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡進(jìn)程的一大類蛋白，目前根據(jù)其氨基酸序列的同源性將其分為六類（IAP1-6）。各類IAPs的結(jié)構(gòu)相似，功能卻不盡相同，有些IAP有促凋亡活性。宿主通過(guò)啟動(dòng)其凋亡程序來(lái)抗病毒感染，而病毒又通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，來(lái)促進(jìn)其自身

2、的增殖傳播。為明確IAPs在苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)抗蟲(chóng)過(guò)程中的作用機(jī)制，開(kāi)展了Ac-IAPs的功能研究，并在此基礎(chǔ)上，探討了Ac-IAP1/2對(duì)重組病毒AcMNPV-BmK IT(P10)細(xì)胞毒性的協(xié)同效應(yīng)。
　　本研究分為三部分:
　　第一部分:凋亡抑制因子Ac-IAP1/2的功能分析。<

3、br>　　我們首先利用Bac-to-Bac昆蟲(chóng)桿狀病毒重組表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了過(guò)表達(dá)Ac-IAP1/2的重組病毒AcMNPV-iap1/2-egfp。然后分別用1 MOI的重組病毒AcMNPV--iap1/2-egfp感染Sf9細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察與Western blot分析結(jié)果表明，Ac-IAP1/2-EGFP的表達(dá)量隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，并在120 h達(dá)到最大。接著，分別用0.001 MOI的野生病毒AcMNPV和重組病毒AcM

4、NPV-iap1/2-egfp感染Sf9細(xì)胞1-4天，蝕斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞和培養(yǎng)液中子代病毒粒子的數(shù)量，結(jié)果表明AcMNPV-iap2-egfp促進(jìn)子代病毒增殖;而AcMNPV-iap1-egfp抑制子代病毒增殖，表明Ac-IAP2可促進(jìn)子代病毒增殖，而Ac-IAP1則執(zhí)行相反的功能。之后，分別用1.5-12 MOI的AcMNPV和AcMNPV-iap1/2-egfp感染Sf9細(xì)胞48h，MTT試劑檢測(cè)Sf9細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表

5、明AcMNPV-iap2-egfp以劑量-依賴的形式促進(jìn)細(xì)胞增殖;AcMNPV-iap1-egfp無(wú)論在正常條件還是營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下，均顯著抑制細(xì)胞增殖。這表明Ac-IAP1具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，Ac-IAP2則可促進(jìn)細(xì)胞增殖。在抗蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)中，分別用20μL，1×107 pfu/mL的AcMNPV-egfp和AcMNPV-iap1/2-egfp連續(xù)飼喂三齡期棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)五天，檢測(cè)棉鈴幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)情況、死亡率及蛹化率。結(jié)果表明，由AcMNPV-

6、iap2-egfp飼喂的棉鈴蟲(chóng)，不僅生長(zhǎng)緩慢，死亡率也遠(yuǎn)高于其他兩個(gè)病毒處理組。而AcMNPV-iap1-gfp飼喂的棉鈴蟲(chóng)，死亡率和化蛹率與野生熒光標(biāo)簽病毒AcMNPV-egfp處理組相差無(wú)幾，表明Ac-IAP1盡管表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但過(guò)表達(dá)Ac-IAP1的病毒AcMNPV-iap1-egfp的殺蟲(chóng)效果不佳，而AcMNPV-iap2-egfp則具有較高抗蟲(chóng)活性。
　　第二部分:BIR2結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏c-IAP2的抗凋亡功能至關(guān)

7、重要。
　　采用GenBank和PDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Ac-IAP1/2的功能域，DNAMAN軟件比對(duì)分析并確定Ac-IAP1/2間序列差異較大的功能域?yàn)锽IR2結(jié)構(gòu)域。我們通過(guò)重疊PCR技術(shù)將Ac-IAP2的BIR2結(jié)構(gòu)域置換為Ac-IAP1的BIR2結(jié)構(gòu)域，并用Bac-to-Bac昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了過(guò)表達(dá)Ac-IAP2突變體Ac-IAP2-BIR1（iap1）的重組病毒AcMNPV--iap2-BIR2(iap1)-egfp。然后，

8、用1 MOI的AcMNPV-iap2-BIR2(iap1)-egfp感染Sf9細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察與Western blot結(jié)果表明，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，被感染的細(xì)胞（即帶綠色熒光的細(xì)胞）顯著增多、細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，Ac-IAP2-BIR2(iap1)-EGFP的表達(dá)量增加，并在120 h達(dá)到最大。接著，分別用3-12 MOI的AcMNPV-iap1/2-egfp和AcMNPV-iap2-BIR2(iap1)-egfp感染Sf9細(xì)

9、胞48 h，MTT試劑檢測(cè)Sf9細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明，與AcMNPV-iap2-egfp僅差一個(gè)BIR2功能域的AcMNPV-iap2-BIR2(iap1)-egfp卻具有比AcMNPV-iap1-egfp更高的細(xì)胞增殖抑制率。這表明Ac-IAP2-BIR2（iap1）促進(jìn)細(xì)胞凋亡，BIR2結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏c-IAP2的抗凋亡功能至關(guān)重要。
　　第三部分:Ac-IAP1/2對(duì)重組病毒AcMNPV-BmK IT(P10)促凋亡活性的

10、協(xié)同效應(yīng)分析。
　　前兩部分實(shí)驗(yàn)已經(jīng)對(duì)Ac-IAP1/2的功能作了分析，那么作為調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的兩個(gè)重要因子，它們是否可提高我們已有的重組蝎昆蟲(chóng)特異性毒素(BmK IT)的AcMNPV-BmK IT的細(xì)胞毒性？鑒于我們前期的研究，早期啟動(dòng)子(IE1)調(diào)控表達(dá)的BmK IT在病毒感染早期可促進(jìn)子代病毒增殖，而早期(IE1)和晚期啟動(dòng)子(P10)調(diào)控表達(dá)的BmK IT均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本節(jié)中，我們首先分析了晚期啟動(dòng)子(P10)調(diào)控表

11、達(dá)的BmK IT對(duì)子代病毒增殖的影響。分別用1 MOI的AcMNPV和AcMNPV--BmK IT(P10)侵染Sf9細(xì)胞，結(jié)果顯示在16-48 h內(nèi)，AcMNPV-BmK IT(P10)處理組細(xì)胞中的病毒粒子積累量均低于野生病毒處理組，表明AcMNPV-BmK IT(P10)可抑制子代病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的累積。接著，用1 MOI的AcMNPV-BmK IT(P10)侵染Sf9細(xì)胞，Real-time PCR結(jié)果表明， BmK IT的轉(zhuǎn)錄

12、水平在病毒感染24 h后，呈減弱趨勢(shì)。而在病毒感染48h時(shí)宿主細(xì)胞內(nèi)的子代病毒粒子積累量有一個(gè)輕微的增長(zhǎng)，這表明BmK IT是抑制宿主細(xì)胞內(nèi)子代病毒粒子積累的原因;之后，用1 MOI的AcMNPV和AcMNPV-BmK IT(P10)侵染Sf9細(xì)胞，Real-time PCR結(jié)果表明在病毒感染早期AcMNPV-BmK IT(P10)處理組中vp39基因的轉(zhuǎn)錄水平高于野生病毒處理組，而感染晚期與之相反。上述結(jié)果共同表明P10啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)

13、的BmK IT，在病毒感染早期，促進(jìn)子代病毒增殖和出芽，而在感染晚期促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制子代病毒的增殖，利于子代病毒傳播。接著，分別用10 MOI的AcMNPV和AcMNPV-BmKIT(P10)侵染Sf9細(xì)胞，DAPI熒光染色結(jié)果顯示，兩病毒處理組的細(xì)胞核形態(tài)和大小沒(méi)有明顯差異，表明重組病毒AcMNPV-BmK IT(P10)對(duì)子代病毒增殖和出芽的影響，并不依賴存在于細(xì)胞核中病毒發(fā)生基質(zhì)的形成。在明確了AcMNPV-BmK IT(P10

14、)在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖的規(guī)律后，我們檢測(cè)了Ac-IAP1/2對(duì)重組病毒AcMNPV-BmK IT(P10)促細(xì)胞凋亡活性的協(xié)同效應(yīng)，分別用AcMNPV-iap1/2-egfp(3MOI)與AcMNPV-BmK IT(P10)(1.5、3和6 MOI)共侵染Sf9細(xì)胞，結(jié)果表明，Ac-IAP1可協(xié)同AcMNPV-BmK IT(P10)促進(jìn)宿主細(xì)胞凋亡，且其細(xì)胞毒性高于BmK IT;Ac-IAP2通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡為BmK IT促進(jìn)子代病毒增殖爭(zhēng)

15、取了時(shí)間，使得子代病毒大量增殖，從而提高了AcMNPV-BmK IT(P10)的細(xì)胞毒性。
　　本研究分別在蟲(chóng)體和細(xì)胞水平上分析了AcMNPV侵染宿主過(guò)程中調(diào)控宿主凋亡的關(guān)鍵因子Ac-IAP1/2的功能，明確了BIR2結(jié)構(gòu)域?qū)c-IAP2抗凋亡功能的重要性，獲得了一株抗蟲(chóng)效率較高的病毒殺蟲(chóng)劑AcMNPV-iap2-egfp，并進(jìn)一步完善了AcMNPV-BmK IT(P10)細(xì)胞毒性機(jī)制及IAPs對(duì)其協(xié)同效應(yīng)的研究。本研究為桿狀病