大鼠胚胎皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及真皮層內(nèi)移植存活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：利用體外組織細(xì)胞培養(yǎng)及胚胎無(wú)瘢痕愈合的一般原理，在體外原代培養(yǎng)胚胎大鼠皮膚成纖維細(xì)胞，探索和建立大鼠胚胎皮膚成纖維絀胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定的技術(shù)方法。觀察大鼠胚胎皮膚成纖維細(xì)胞在正常皮膚以及深二度燒傷創(chuàng)面注射移植后的存活情況。 方法：分別用組織塊法和酶消化分離法原代培養(yǎng)處于無(wú)瘢痕愈合期的Wistar大鼠胚胎皮膚成纖維細(xì)胞，對(duì)兩種方法獲得細(xì)胞的情況進(jìn)行比較。用胰蛋白酶+EDTA消化加反復(fù)貼壁法分離純化成纖維細(xì)胞。倒置相差顯

2、微鏡下觀察原代培養(yǎng)及傳代過(guò)程中成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。制備細(xì)胞爬片，對(duì)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞用SP方法作免疫細(xì)胞化學(xué)染色(immunocytochemistry，ICC)，第一抗體分別為波形蛋白(vimentin)、結(jié)蛋白(desmin)、角蛋白(pan cytokeratin)。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，制作標(biāo)本，用透射電子顯微鏡(transmission electron microscoDe，TEM)觀察胚胎成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

3、 用組織塊法和酶消化法對(duì)成年Wistar大鼠皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)兩類細(xì)胞生長(zhǎng)以及功能活動(dòng)情況進(jìn)行簡(jiǎn)單的比較研究。細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。流式細(xì)胞術(shù)(now cvtometrv，F(xiàn)CM)測(cè)定比較處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期情況，細(xì)胞各周期的百分比測(cè)定結(jié)果以x±S表示，作組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 選擇成年健康Wistar大鼠12只，每只體重約250g左右，隨機(jī)分為

4、兩組，A組為正常皮膚移植組，B組為燒傷創(chuàng)面移植組。A組每只背部選擇兩個(gè)直徑為3cm移植區(qū)域，B組每只大鼠背部制造兩處直徑為 3cm的深二度燒傷創(chuàng)面(經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí))。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng) 狀態(tài)良好的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用羰花青類熒光活性染料衍生物CM-Dil(Chloromethylbenzamido derivatives of Dil)進(jìn)行標(biāo)記，注射移 植于A、B組皮膚真皮層內(nèi)。移植后分別于1、3、7、14、21、28d 6

5、 個(gè)時(shí)相點(diǎn)取材，做冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞存活情況。 結(jié)果： 1．與組織塊法相比，用酶消化法可更快捷地獲得更多的成纖維細(xì)胞，分離的成纖維細(xì)胞可在體外快速貼壁生長(zhǎng)、增殖，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、單核。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示波形蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，而結(jié)蛋白、角蛋白呈陰性反應(yīng)，透射電鏡觀察結(jié)果為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。 2．細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示胚胎大鼠皮膚成纖維細(xì)胞比成年大鼠皮膚成纖維細(xì)胞有更強(qiáng)的增

6、殖分裂能力。流式細(xì)胞儀對(duì)兩種細(xì)胞周期的分析結(jié)果顯示，胚胎皮膚成纖維細(xì)胞S期百分比明顯多于成年皮膚成纖維細(xì)胞(P<0.05)。 3．胚胎皮膚成纖維細(xì)胞移植后熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示：A組各時(shí)相點(diǎn)均有信號(hào)存在，第1天、第3天熒光信號(hào)較少，第7天開(kāi)始增多，第14天、第21天時(shí)熒光信號(hào)最多，且分布均勻，第28天仍有信號(hào)存在；B組第1天、第3天有熒光信號(hào)存在，第7天僅有微弱熒光信號(hào)，以后各時(shí)相點(diǎn)均未檢測(cè)到熒光信號(hào)。 結(jié)論：