應(yīng)用犬真皮成纖維細(xì)胞構(gòu)建半月板的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、種子細(xì)胞是纖維軟骨組織工程研究的重要內(nèi)容。真皮成纖維細(xì)胞(DFs)是真皮組織中合成細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，也是人體中分布最為廣泛，數(shù)量最多，最易于獲取和體外培養(yǎng)的細(xì)胞。我實(shí)驗(yàn)室早期的研究發(fā)現(xiàn)軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(CDMP1)可以誘導(dǎo)人DFs向軟骨細(xì)胞表型分化。本課題將深入探索DFs作為纖維軟骨種子細(xì)胞的可能性和可行方案。 第一部分應(yīng)用含有100ng/ml CDMP1軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)成年Beagle犬腹部皮膚分離培養(yǎng)的第4代DFs。6天

2、后，部分DFs呈星形或多角形，免疫組化染色顯示有軟骨特異的II型膠原分泌，RT-PCR檢測(cè)也表明有II型膠原，aggrecan和Sox9表達(dá)，但是誘導(dǎo)10天時(shí)，這些表達(dá)均轉(zhuǎn)為陰性。表明CDMP1可以誘導(dǎo)DFs向軟骨細(xì)胞表型分化，但不能長(zhǎng)期維持。 第二部分我們以聚羥基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)作為支架材料，為DFs提供一個(gè)三維的生長(zhǎng)環(huán)境，以含有CDMP1的軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)細(xì)胞材料復(fù)合物。對(duì)體外培養(yǎng)4周和6周的復(fù)合物進(jìn)行組織學(xué)和免

3、疫組織化學(xué)的染色，觀察纖維軟骨的形成。定量PCR測(cè)定纖維軟骨特異性基因的表達(dá)。結(jié)果：CDMP1誘導(dǎo)組中細(xì)胞增殖和細(xì)胞合成GAG量明顯較對(duì)照組高，體外培養(yǎng)4周后，誘導(dǎo)組復(fù)合物中形成纖維軟骨樣組織，6周后，形成的組織更加成熟，而且，I型、II型膠原、GAG和aggrecan都有較高的表達(dá)。而對(duì)照組中只有I型膠原和微量aggrecan表達(dá)，因而可以確定CDMP1具有誘導(dǎo)DFs構(gòu)建組織工程纖維軟骨的作用。 第三部分將體外誘導(dǎo)培養(yǎng)2周的半

4、月板形細(xì)胞材料復(fù)合物回植入體內(nèi)，修復(fù)犬自體半月板的全缺損模型，回植3個(gè)月和6個(gè)月后取材，對(duì)新生的半月板組織進(jìn)行組織學(xué)和免設(shè)組織化學(xué)染色。結(jié)果：誘導(dǎo)組在術(shù)后3個(gè)月時(shí)，新生的半月板組織中細(xì)胞呈典型的軟骨細(xì)胞形態(tài)特征；6個(gè)月時(shí)，形成的組織與正常半月板組織非常相似，不僅細(xì)胞呈軟骨細(xì)胞特征，而且細(xì)胞外基質(zhì)中有大量平行排列的膠原纖維。而在對(duì)照組中未見(jiàn)有典型的纖維軟骨樣組織形成。 總之，本課題研究證明，DFs在CDMP1的作用下可以向纖維軟骨