Myod1和Myog真核共表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染真皮成纖維細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、目的：多年來，失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮始終是骨科學(xué)研究領(lǐng)域中的一個重要并亟需突破的理論難題，逆轉(zhuǎn)骨骼肌纖維化的研究更加具有挑戰(zhàn)性。目前，運用轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因治療是極具潛力和應(yīng)用前景的治療方法，也是各個學(xué)科前沿研究的熱點。在調(diào)控骨骼肌發(fā)生、分化和成熟的過程中，生肌調(diào)節(jié)因子家族發(fā)揮著決定性作用。因此，應(yīng)用生肌調(diào)節(jié)因子進(jìn)行基因治療以逆轉(zhuǎn)骨骼肌纖維化，可能具有較高的研究價值。以前的研究結(jié)果顯示，針對失神經(jīng)骨骼肌萎縮，利用單一基因進(jìn)行基因治療可以發(fā)揮

2、一定的治療作用，但是，總地來說療效不佳，需要進(jìn)一步提高。由于生肌調(diào)節(jié)因子家族中的各個成員在發(fā)揮調(diào)控骨骼肌分化的作用時，具有相互協(xié)同和相互促進(jìn)的作用，因此探索雙基因聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行基因治療以逆轉(zhuǎn)骨骼肌纖維化是一項很有價值研究課題，能夠為防治失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮尋找新的思路，并且提供基礎(chǔ)研究的實驗依據(jù)。由于Myod1和Myog是生肌調(diào)節(jié)因子家族中最為重要的兩個成員，因此，本研究選取Myod1和Myog作為研究對象，探討二者聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染對于誘導(dǎo)真

3、皮成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為成肌細(xì)胞的作用，以期為逆轉(zhuǎn)失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮尋找新的治療靶點。（1）通過克隆Myod1具基因和Myog基因的cDNA，構(gòu)建Myod1和Myog各自的克隆載體，進(jìn)一步構(gòu)建Myod1和Myog二者的真核共表達(dá)載體，為下一步進(jìn)行Myod1和Myog聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染防治骨骼肌失神經(jīng)萎縮的細(xì)胞學(xué)研究提供實驗基礎(chǔ)。（2）通過原代培養(yǎng)大鼠真皮成纖維細(xì)胞，為下一步進(jìn)行Myod1和Myog真核共表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染的細(xì)胞學(xué)實驗提供理想的細(xì)

4、胞基礎(chǔ)。（3）應(yīng)用Myod1和Myog真核共表達(dá)載體對原代培養(yǎng)的大鼠真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實驗，檢測轉(zhuǎn)染后的真核共表達(dá)載體能否正確表達(dá)Myod1蛋白和Myog蛋白，觀察并鑒定Myod1和Myog基因聯(lián)合體外轉(zhuǎn)染能否使來源于大鼠皮膚真皮層的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為成肌細(xì)胞，為逆轉(zhuǎn)骨骼肌纖維化的治療提供新的靶點。
　　方法：（1）通過RT-PCR的方法克隆大鼠Myod1基因和Myog基因的全長cDNA，將Myod1和Myog的cDNA

5、分別連接到克隆載體pMD18，構(gòu)建重組的pMD18-Myod1和pMD18-Myog克隆載體，利用大腸桿菌擴(kuò)增克隆載體，提取、純化克隆載體，酶切克隆載體獲得Myod1基因和Myog基因的cDNA，將二者依次插入到pVAX1載體中，構(gòu)建出重組的Myod1和Myog真核共表達(dá)載體pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP，采用測序的方法對其進(jìn)行鑒定，驗證所構(gòu)建的真核共表達(dá)載體的正確性。（2）從大鼠皮膚真皮層提取成纖維

6、細(xì)胞，在分離、純化后進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，采用免疫熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測細(xì)胞特異性成分Vimentin和Desmin，以確定所培養(yǎng)細(xì)胞種類為成纖維細(xì)胞。（3）應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000作為媒介，將Myod1和Myog的真核共表達(dá)載體pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP對原代培養(yǎng)的大鼠真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，利用WesternBlot檢測Myod1蛋白和Myog蛋白

7、的表達(dá)，驗證真核共表達(dá)載體能否正確表達(dá)目的蛋白；利用免疫熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)方法對成纖維細(xì)胞是否能夠發(fā)生轉(zhuǎn)分化進(jìn)行鑒定，明確Myod1和Myog的真核共表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染能否使原代培養(yǎng)的大鼠真皮成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成肌細(xì)胞。
　　結(jié)果：（1）測序鑒定結(jié)果表明：重組的pMD18-Myod1和pMD18-Myog克隆載體中所克隆的Myod1和MyogcDNA的長度及堿基序列均正確，證實本實驗所克隆的Myod1和MyogcDNA序列與Gene

8、bank所報道的序列一致。（2）測序鑒定結(jié)果表明：重組的Myod1和Myog真核共表達(dá)載體pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP內(nèi)的Myod1和MyogcDNA的序列長度及堿基順序均正確，證實本實驗所克隆的Myod1基因和Myog基因的cDNA序列與Genebank所報道的序列一致。（3）Vimentin染色和Desmin染色檢測結(jié)果表明原代培養(yǎng)的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，本實驗所培養(yǎng)的細(xì)胞中沒有出現(xiàn)Desmin染色

9、陽性的成肌細(xì)胞。（4）在轉(zhuǎn)染實驗中，WesternBlot能夠檢測到有Myod1蛋白和Myog蛋白的表達(dá)，證實Myod1和Myog的真核共表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后能夠正確表達(dá)Myod1蛋白和Myog蛋白。（5）在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)能夠能夠檢測到Desmin染色陽性表達(dá)，證實Myod1和Myog真核共表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染后能夠使原代培養(yǎng)的大鼠真皮成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成肌細(xì)胞。
　　結(jié)論：（1）本研究正確克隆了Myod1和Myog的cDNA

10、。（2）本研究正確構(gòu)建了重組pMD18-Myod1克隆載體和重組pMD18-Myog克隆載體。（3）本研究正確構(gòu)建了重組Myod1和Myog真核共表達(dá)載體pVAX1-Myod1-IRES2-Myog-IRES2-EGFP。（4）本研究能夠從大鼠皮膚真皮層原代培養(yǎng)出純度較高的成纖維細(xì)胞。（5）本研究所構(gòu)建的重組Myod1和Myog的真核共表達(dá)載體在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下能夠有效地轉(zhuǎn)染到原代培養(yǎng)的大鼠真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)，并且能夠表達(dá)結(jié)構(gòu)正確的Myod