NYD-SP15基因的原核表達(dá)、抗體的制備以及細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因LIMS E的克隆分析.pdf

1、目的： 第一部分：通過(guò)構(gòu)建與增生性病變相關(guān)基因NYD-SP15的原核表達(dá)質(zhì)粒，體外誘導(dǎo)NYD-SP15蛋白的表達(dá)，免疫小鼠獲得抗體，并把獲得的多克隆抗體運(yùn)用于增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變的免疫組化研究。 第二部分：研究Lims基因在PVR發(fā)生過(guò)程中RPE細(xì)胞發(fā)育中的作用。 方法： 第一部分：應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增NYD-SP15全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框，構(gòu)建PET28a-NYD-SP15載體，再將其轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株， IPTG誘

2、導(dǎo)表達(dá)，Ni柱純化，免疫BALB/C小鼠，Western-blot法檢測(cè)純化的蛋白和抗體，取視網(wǎng)膜增殖膜臨床標(biāo)本，抗體行免疫組化染色。 第二部分：應(yīng)用巢式RT-PCR，以小鼠cDNA為模板，擴(kuò)增Lims基因不同剪切子，構(gòu)入PinPointTM Xa-1P質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。 結(jié)果： 第一部分：成功地構(gòu)建了PET28a-NYD-SP15原核表達(dá)質(zhì)粒，并獲得了高效表達(dá)NYD-SP15的BL21菌株，表達(dá)的His標(biāo)簽融合蛋

3、白，分子量為58KD左右，經(jīng)免疫小鼠獲得了抗NYD-SP15抗體。經(jīng)Western-blot法分析，抗體為NYD-SP15特異性抗體。免疫組化染色顯示，NYD-SP15基因表達(dá)于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的胞漿，呈現(xiàn)棕色染色。第二部分：測(cè)序表明克隆了新的Lims基因變異剪切體Lims E，該變異剪切體編碼區(qū)為1164 bp，編碼387個(gè)氨基酸。 結(jié)論： 第一部分：構(gòu)建的NYD-SP15基因的原核表達(dá)載體，體外高效表達(dá)蛋白，免疫小