隨機RNA文庫技術(shù)的建立及其應(yīng)用.pdf

1、指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進化(SELEX)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的研究核酸結(jié)構(gòu)、功能及進化的一種新的組合化學技術(shù).它在基礎(chǔ)醫(yī)學、臨床診斷及藥物篩選方面具有廣泛的應(yīng)用前景.該研究的目的是建立并完善隨機RNA文庫技術(shù),并篩選牛凝血酶和噬菌體末端酶大亞基gp16特異結(jié)合的抑制性RNA配基,為新型藥物篩選及抗病毒研究提供理論基礎(chǔ)及實驗依據(jù).該研究利用基因工程方法在大腸桿菌表達并純化了T7RNA聚合酶,該酶具有很好的體外轉(zhuǎn)錄活性.1mg純化的T7RNA

2、聚合酶相當于250U Promega產(chǎn)品.我們采用全長68nt,隨機區(qū)由25個堿基構(gòu)成的RNA文庫,篩選獲得了與牛凝血酶特異結(jié)合的配基.配基高度富集為2條序列,它們與牛凝血酶的親和力較高,解離常數(shù)分別為164nmol/L和240nmol/L.RNA配基能夠體外抑制牛凝血酶的催化酶切活性,是作用在牛凝血酶的肝素結(jié)合位點上.對其進行結(jié)構(gòu)分析表明,隨機區(qū)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).針對配基的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)設(shè)計并篩選到能夠迅速逆轉(zhuǎn)RNA配基