建立cdna文庫時(shí)cdna的合成條件

1、<p>　　建立cDNA文庫時(shí)cDNA的合成條件</p><p>　　作者：黃寶成　陳志南　黃文晉　姜紹諄 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 cDNA合成 </p><p>　　關(guān)鍵詞: cDNA合成;逆轉(zhuǎn)錄酶;溫度;時(shí)間 </p><p><b>　　0 引言 </b></p><p&

2、gt;　　建立cDNA文庫并從中篩選出目的基因是一種十分有效的尋找未知基因的手段.cDNA文庫的構(gòu)建過程可粗分為總RNA的提取，mRNA的純化，cDNA的合成以及將cDNA克隆入載體等幾個(gè)主要步驟，其中cDNA的合成是其中最復(fù)雜也是文庫建立成敗的關(guān)鍵步驟.我們?cè)诮⒏伟┘?xì)胞cDNA文庫時(shí)經(jīng)歷了多次cDNA的合成過程，對(duì)其中的某些條件作了比較研究，得到了一些有益的經(jīng)驗(yàn). </p><p><b>　　1

3、材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料 合成cDNA所用mRNA是從肝癌細(xì)胞系HHCC提取;禽源反轉(zhuǎn)錄酶AMV系Promega公司產(chǎn)品;基因工程反轉(zhuǎn)錄酶ExpandTM Reverse Transcriptase系寶靈曼公司產(chǎn)品;［α32 P］-dCTP系北京亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司產(chǎn)品;紫外分光光度計(jì)Spectrometer lambda14系Perkin Elmer公司產(chǎn)品;放射性計(jì)

4、數(shù)儀Radiation Monitor系美國SE公司產(chǎn)品. </p><p>　　1.2 合成cDNA時(shí)反轉(zhuǎn)錄酶的選擇 mRNA經(jīng)過紫外分光光度計(jì)驗(yàn)證其純度并準(zhǔn)確定量后分成2份，1份以AMV為反轉(zhuǎn)錄酶，另1份以ExpandTM Reverse Transcriptase為反轉(zhuǎn)錄酶，2份反應(yīng)均以O(shè)ligo（dT）15 為引物，在反應(yīng)體系中加入［α32 P］-dCTP.反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行14g&#12539;L

5、-1 的堿性瓊脂糖凝膠電泳，壓上X光片.24h后顯影以觀察合成效果，具體操作參照文獻(xiàn)［1］.相同實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次. </p><p>　　1.3 cDNA合成過程中反應(yīng)溫度和時(shí)間的控制 在確定了反轉(zhuǎn)錄酶的種類之后，將cDNA合成反應(yīng)分成2組，進(jìn)行兩種不同溫度和時(shí)間過程的控制.第1組按傳統(tǒng)方法，即以42℃，60min合成cDNA第一鏈，然后16℃，4h合成cDNA第二鏈;第2組以42℃，45min然后升溫至48℃

6、，15min合成cD-NA第一鏈，以12℃，60min，22℃，60min合成cDNA第二鏈，兩組同樣以［α32 P］-dCTP摻入法驗(yàn)證cDNA合成效果.同位素?fù)饺肭闆r以cDNA電泳后放射性計(jì)數(shù)儀測(cè)得的每分鐘計(jì)數(shù)為準(zhǔn). </p><p><b>　　2 結(jié)果和討論 </b></p><p>　　2.1 構(gòu)建cDNA文庫對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶的質(zhì)量要求高 經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)

7、以AMV為反轉(zhuǎn)錄酶合成的cDNA第一鏈比較正常，片段分布區(qū)域較寬，而第二鏈合成卻有比較突出的缺陷，片段分布范圍較窄（小于4.0kb），片段集中區(qū)分子量偏?。ㄐ∮?.0kb），有明顯的降解現(xiàn)象.這種結(jié)果可能與AMV本身含有較強(qiáng)的RNaseH活性及在酶的生產(chǎn)過程中難以避免污染有核酶內(nèi)切酶有關(guān)［2］ .以ExpandTM Reverse Transcrip-tase為反轉(zhuǎn)錄酶合成的cDNA兩鏈均正常，特別是cDNA第二鏈分布較廣（從0.3～9

8、.0kb），且片段集中區(qū)在2.0kb上下，完全符合哺乳動(dòng)物細(xì)胞mRNA的分布規(guī)律.此酶為基因工程產(chǎn)品，它的RNaseH活性已被突變掉，且它的生產(chǎn)過程也可避免外源性污染.構(gòu)建文庫的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)有它不同于其他逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（如RT-PCR）的特點(diǎn):cDNA合成反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間長，合成的cDNA片段長度不均一且片段大小分布范圍廣.所以它對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶的要求也較高，我們?cè)跇?gòu)建文庫時(shí)應(yīng)充分考慮這一點(diǎn). </p><p>　　2.2 c

9、DNA合成反應(yīng)時(shí)間可以縮短 放射性計(jì)數(shù)值與cD-NA的合成量是呈正相關(guān)的，我們對(duì)3次實(shí)驗(yàn)中2組不同溫度、時(shí)間控制下合成的cDNA進(jìn)行了計(jì)數(shù).結(jié)果組1的3次反應(yīng)計(jì)數(shù)值分別為16850，16778和16760r&#12539;min-1 （平均值為16796r&#12539;min-1 ）.組2的3次反應(yīng)計(jì)數(shù)值分別為16876，16802和17118r&#12539;min-1 （平均值為16932r&#1

10、2539;min </p><p>　　-1 ）.2組計(jì)數(shù)值雖略有差別，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在2組反應(yīng)條件下cDNA的合成效果相當(dāng).第2組反應(yīng)條件是我們針對(duì)酶的特性制定的［3］ ，當(dāng)反轉(zhuǎn)錄酶作用42℃，45min時(shí)，大部分mRNA模板會(huì)被反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，但可能也有少數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的mRNA不能被反轉(zhuǎn)錄.當(dāng)我們升溫至48℃再反應(yīng)15min，可以將這部分有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.cDNA第二

11、鏈合成時(shí)，先在12℃低溫反應(yīng)，以保證RNaseH在低活性狀態(tài)下即能在mRNA/cDNA雜合鏈上使mRNA產(chǎn)生缺口，又不至于產(chǎn)生大的缺失，再將反應(yīng)陡升至22℃以便最大限度地發(fā)揮DNA聚合酶活性，快速將mRNA置換成cDNA第二鏈，這樣就大大縮短了反應(yīng)時(shí)間（較傳統(tǒng)方法縮短2h），提高了工作效率. </p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?/p>

12、1］薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T（金冬雁，黎孟楓等譯）.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.第2版.北京:科學(xué)出版社，1992:437-441. </p><p>　?。?］Verma IM.Reverse transcripatase.In:Boyer PD ed.The en-zymes ［M］.3rd ed.New York:Academic Press，1981;14:87-95. </p>