siRNA干擾ski的表達以及對人肝癌HepG-,2-細胞生物學功能影響的研究.pdf

1、ski是Stavanezer等人于1986年首先在感染了禽類白血病轉(zhuǎn)化缺陷病毒Bratislava77的雞胚細胞中發(fā)現(xiàn)的。它在不同類型的細胞和組織中分布廣泛,尤其在多種腫瘤細胞中均存在著過量的異常表達。ski作為細胞內(nèi)的原癌基因,具有多種生物活性,參與體內(nèi)多種生理病理過程。對Ski蛋白生物活性及在各種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中作用機制的研究是目前生命科學領(lǐng)域的一大熱點。那么進一步探索ski對腫瘤細胞生物學功能的影響對于上述命題則具有重要的意

2、義。 ski是TGF-β通路的主要負性調(diào)控因子,它通過抑制Smad家族復(fù)合物來拮抗TGF-β對細胞生長的抑制作用,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。 研究表明Ski蛋白具有促進細胞惡性轉(zhuǎn)化的作用。由于其沒有內(nèi)在的催化活性,所以必須通過與其他細胞成分如Smad蛋白的相互作用來實現(xiàn)這一功能,而TGF-βSmads傳導(dǎo)通路是已知與Ski致瘤作用關(guān)系最為密切的家族之一。同時,大量臨床病例顯示,Ski在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是復(fù)雜的：一方面

3、,在人類許多腫瘤如惡性黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、肺癌、胃癌、表皮樣瘤及前列腺癌中均已發(fā)現(xiàn)Ski的過量異常表達,并被證實是食道癌、乳腺癌、大腸癌預(yù)后不良的重要因素之一；另一方面,Ski在少數(shù)情況下有一定的腫瘤抑制作用,如鼠ski的非等位缺失能提高其對化學誘癌的敏感性。Ski是TGF-β通路的主要負性調(diào)控因子,它在腫瘤發(fā)生過程中的多樣性與TGF-β對腫瘤的雙重作用(早期抑制,中后期促進侵潤和轉(zhuǎn)移)之間是否存在著重大關(guān)系,是目前分子醫(yī)學急需攻

4、克的難題。 本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn),Ski在人肝癌HepG2細胞中異常高度表達,表達量是人正常肝細胞LO2的18倍左右,提示Ski與肝癌的發(fā)生關(guān)系密切,所以ski有可能成為肝癌治療的新型靶點?？紤]到ski廣泛參與多種重要的生命活動,加之目前尚無關(guān)于ski與肝癌細胞增殖、凋亡等功能關(guān)系的報道,因此本課題著眼于ski對肝癌細胞生物學功能影響的研究。 鑒于RNA干擾技術(shù)是研究基因功能的強大工具,目前被廣泛應(yīng)用于生命科學的各項研

5、究。所以本課題選用針對ski的小分子RNA干擾片段瞬間轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細胞,剔降胞內(nèi)ski表達水平來監(jiān)控肝癌細胞生物學功能方面指標的變化。相信這一研究將對腫瘤基因治療提供了一條新的思路和方法。 我們設(shè)計并化學合成針對原癌基因ski的3個siRNA分子序列,陽離子脂質(zhì)體法瞬間轉(zhuǎn)染HepG2細胞,運用實時定量PCR法和Western-Blotting法檢測細胞中ski在mRNA水平和蛋白水平的變化。然后利用MTT法和流式細胞儀檢

6、測轉(zhuǎn)染ski-siRNA的HepG2細胞的增殖、周期和凋亡等生物學功能方面指標的變化。課題研究的內(nèi)容包括以下三個主要部分： 1.瞬間轉(zhuǎn)染hski-siRNA研究HepG2細胞中ski mRNA水平和蛋白水平的表達; 2.siRNA干擾ski的表達對人肝癌HepG2細胞生物學功能的影響; 3.ski-siRNA對Ski下游周期相關(guān)蛋白表達的調(diào)節(jié) 通過實驗發(fā)現(xiàn),三對特異性ski-siRNA均有效的抑制ski的

7、表達,以siRNA-B抑制效果最好,可達到70％,而且隨著轉(zhuǎn)染時間的延長,ski的表達呈逐步下降趨勢。HepG2細胞的增殖能力明顯受到抑制(P<0.05),S期細胞明顯減少,是陰性對照組的2倍以上。但凋亡效果并不明顯。而且ski基因沉默后,TGF-β通路下游的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p15,p27的蛋白表達隨轉(zhuǎn)染時間的延長均明顯下調(diào),而p21蛋白的改變不大。因此可知,靶向ski基因的siRNA分子片段可以有效地抑制人肝癌HepG2