CD147過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞生物學(xué)功能的影響.pdf

1、背景與目的： 侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的生物學(xué)特性，也是腫瘤致死的重要因素。研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療具有重要意義。腫瘤轉(zhuǎn)移的方式主要有淋巴道轉(zhuǎn)移、血道轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移。腫瘤發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚有待研究。研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移不僅與機(jī)體微環(huán)境有關(guān)，還與腫瘤細(xì)胞自身特性密切相關(guān)，其中細(xì)胞表面糖蛋白的糖基化調(diào)節(jié)起重要作用。 CD147分子，又名EMMPRIN，屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin

2、superfamily,IGSF)的跨膜糖蛋白，是細(xì)胞膜的監(jiān)視分子。CD147由2個(gè)胞外Ig結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。從CD147的N端起，第1個(gè)胞外Ig結(jié)構(gòu)域與MMPs誘導(dǎo)活性及CD147自身寡聚有關(guān)；第2個(gè)胞外Ig結(jié)構(gòu)域與窖蛋白Caveolin-1(Cav-1)存在相互作用。由于N-糖基化不同，CD147同時(shí)表現(xiàn)為高糖型CD147(HG-CD147，分子量40-66KD)和低糖型CD147(LG-CD147，分子量

3、33KD)，但CD147糖基化與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不明確。CD147主要通過(guò)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶活性參與組織重構(gòu)，在機(jī)體發(fā)育、生殖等多種生理過(guò)程，以及腫瘤、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍等多種病理過(guò)程中發(fā)揮作用。另一方面，CD147已被證實(shí)在多種腫瘤尤其是惡性腫瘤組織中表達(dá)增加，目前CDl47已在肺癌、肝癌、腦膠質(zhì)瘤、食道癌、喉癌、卵巢癌、乳腺癌等癌細(xì)胞中檢測(cè)出來(lái)。作為存在于腫瘤細(xì)胞表面的一種粘附分子，CD147介導(dǎo)腫瘤和基質(zhì)之間的相互作用，誘導(dǎo)成纖維

4、細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞自身MMPs生成，加速腫瘤血管的生成，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。目前影響CD147水平表達(dá)活性的調(diào)節(jié)劑有糖基化、生長(zhǎng)因子、激素和膜脫落等。其中，糖基化對(duì)CD147的誘導(dǎo)活性起關(guān)鍵性作用。 本文通過(guò)克隆小鼠CD147的cDNA、構(gòu)建其表達(dá)載體并將其穩(wěn)定過(guò)表達(dá)于小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中，觀察CD147糖型和Hepa1-6細(xì)胞生物學(xué)的變化，旨在闡明CD147的糖基化及其調(diào)節(jié)在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物設(shè)計(jì)提供有

5、價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和線索。 方法： 1．從小鼠肝癌細(xì)胞HcaF中提取總RNA，利用CD147特異性引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增CD147cDNA11-830bp片段，克隆至PMD18-T simple vector，然后亞克隆到真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3.1上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、抗生素初步篩選、限制性核酸內(nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1/CD147。 2．利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pcDNA3.1/CD147轉(zhuǎn)染至小鼠

6、肝癌細(xì)胞Hepa1-6上，空載體做對(duì)照，經(jīng)G418篩選及RT-PCR和Western blot分析，獲得穩(wěn)定表達(dá)株。 3．Western blot分析穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CD147的糖型變化，并利用體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化。 結(jié)果： 1．利用RT-PCR從小鼠肝癌細(xì)胞HcaF總RNA中成功克隆出850bp的CD147cDNA的11-830bp片斷，重組陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)目的基

7、因已正確插入pcDNA3.1表達(dá)載體中，且與載體上的c-myc基因處于同一開(kāi)放閱讀框，記為pcDNA3.1/CD147。 2．利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，經(jīng)G418篩選，RT-PCR、Western blot分析，獲得了2個(gè)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)外源CD147的Hepa1-6細(xì)胞株，記為Hepa1-6/CD147。 3．CD147過(guò)表達(dá)的小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中，高糖型和低糖型CD147的表達(dá)均有增加，細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)。