Ox-LDL、HDL對血小板表達(dá)CD147的影響.pdf

1、急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)，包括急性心肌梗死及不穩(wěn)定性心絞痛，是一類致死、致殘率極高的急性心血管事件，大多數(shù)ACS的發(fā)生由動脈粥樣易損斑塊（不穩(wěn)定斑塊）突然破裂并繼發(fā)急性血栓所致。動脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性與多種因素有關(guān)，包括大的脂質(zhì)核心、巨噬細(xì)胞的大量浸潤、纖維帽變薄、內(nèi)皮功能嚴(yán)重不良、斑塊中平滑肌及蛋白聚糖基增多、斑塊表面血小板聚集、斑塊內(nèi)出血等，其中斑塊的纖維帽變薄是導(dǎo)致斑塊在高血流狀態(tài)或

2、其他刺激狀態(tài)下突然破裂的重要因素之一。纖維帽的主要成分是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，而基質(zhì)金屬蛋白酶(extracellular matrixmetalloproteinase，MMPs)可以分解細(xì)胞外基質(zhì)，從而導(dǎo)致纖維帽因主要成分降解而發(fā)生斑塊破裂。CD147，又名細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑(extracellularmatrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)

3、，可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞（包括單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等）分泌MMPs，MMPs可降解斑塊纖維帽主要成分細(xì)胞外基質(zhì)，加速斑塊不穩(wěn)定，引發(fā)急性心血管事件。
　　 CD147最早發(fā)現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞，但廣泛存在于多種細(xì)胞中，包括單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等多種細(xì)胞中。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CD147作為一種新型受體存在于血小板的α顆粒及血小板的開放管道系統(tǒng)(open canalicular system，OCS)，在血小板被激活劑刺

4、激時釋放到血小板表面，而表達(dá)于血小板表面的CD147，第一，可以反過來促進(jìn)血小板的活化，第二，可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)，而MMP-9是可以導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)分解的很強(qiáng)的分解酶。第三，由CD147誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（membrane type1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）可以在CD147的作用下促進(jìn)單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞攝取氧化性低密度脂蛋白（Oxidiz

5、ed low-density lipoprotein，ox-LDL，低密度脂蛋白被氧化后），加快泡沫細(xì)胞的生成，從而加速動脈粥樣硬化進(jìn)程。
　　 第四，CD147還可以促進(jìn)血小板與單核細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)單核細(xì)胞向血管壁遷移，加快動脈粥樣硬化的進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)血液血小板上CD147的表達(dá)與冠心?。–oronary Heart Disease，CHD）成正相關(guān)，與正常人相比，冠心病病人的血小板上CD147的表達(dá)明顯增高，并且

6、循環(huán)血小板CD147的表達(dá)也與年齡相關(guān)，老年人的血小板CD147表達(dá)較高。
　　 Ox-LDL通過啟動泡沫細(xì)胞的形成、直接損害血管內(nèi)皮細(xì)胞使血管內(nèi)皮功能受損、促使多種炎性介質(zhì)的分泌而參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)程。Ox-LDL是低密度脂蛋白被氧化后的產(chǎn)物，在正常人的血液中含量極低，而在動脈粥樣硬化患者或者冠心病患者體內(nèi)明顯升高，在斑塊部位更高。研究表明，血液中ox-LDL水平的高低與急性冠脈綜合征的嚴(yán)重程度也密切相關(guān)。
　　

7、 動脈粥樣硬化患者體內(nèi)存在的ox-LDL可以與血小板發(fā)生作用，有研究表明急性冠脈綜合征的病人體內(nèi)ox-LDL與血小板的結(jié)合體明顯增高。Ox-LDL是血小板獨(dú)立的激活劑，可以促進(jìn)血小板聚集，甚至顆粒釋放。盡管也有學(xué)者認(rèn)為低濃度的ox-LDL抑制了血小板的活化，但是ox-LDL通過與血小板上CD36、LOX-1、SR-A等多種受體結(jié)合而激活血小板已廣泛被接受。
　　 Ox-LDL可以誘導(dǎo)冠狀動脈平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌CD147，

8、然而ox-LDL是否可以誘導(dǎo)血小板CD147的表達(dá)目前尚不清楚，血小板的活化在急性冠脈綜合征的發(fā)生中起重要作用，ox-LDL與急性冠脈綜合征的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，CD147又是促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定的重要物質(zhì)，ox-LDL是不是會通過誘導(dǎo)血小板上調(diào)CD147從而加速斑塊不穩(wěn)定目前尚不清楚。
　　 高密度脂蛋白（High low-density lipoprotein，HDL）可以通過逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇（reverse cholesterol

9、transport，RCT）、保護(hù)內(nèi)皮功能、抗炎抗氧化等多種途徑對血管起保護(hù)作用。此外，HDL可以通過與血小板上清道夫受體B族(Ⅰ)(SR-BI)結(jié)合從而抑制血小板的活化。然而，HDL對于血小板CD147的表達(dá)是否也有抑制作用目前尚不清楚。
　　 本實(shí)驗在體外，以ox-LDL、HDL對血小板直接干預(yù)，采血流式細(xì)胞儀、ELISA、共聚焦顯微鏡、透射電鏡等手段研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL上調(diào)了血小板CD147表達(dá)，而HDL抑制了ox-LD

10、L誘導(dǎo)的血小板CD147上調(diào)。
　　 [材料與方法]
　　 1、實(shí)驗對象
　　 以本院健康志愿者新鮮靜脈血來提取血小板。供血者入選條件:(1)無高血壓、糖尿病、腎病、心腦血管疾病、血液病、肝病及傳染病;(2)不吸煙;(3)近2周內(nèi)未服用任何藥物;(4)24小時內(nèi)未曾飲酒;(5)前臂靜脈暴露明顯或較粗（前臂靜脈主要指肘前靜脈、或頭靜脈，若纖細(xì)，由于采用較粗針頭不易采血順利）;(6)至少空腹12小時。
　　

11、2、實(shí)驗方法
　　 2.1提取血小板
　　 2.1.1采集靜脈血
　　 室溫在22℃-24℃下，由經(jīng)培訓(xùn)的采血護(hù)士采血，選肘中靜脈，以21G蝶形針頭穿刺，用2支20mL注射器勻速抽拉采血共28mL，分別棄前2mL血后立即注入盛有抗凝劑ACD-A(2.5％檸檬酸鹽，1.4％檸檬酸，2％葡萄糖)的離心管中，抗凝劑與全血體積比為1∶6。立即輕柔混勻。
　　 2.1.2制備洗滌血小板
　　 主要步驟:(1

12、)、獲得富含血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP):將離心機(jī)預(yù)溫至24℃，以100 xg相對離心力離心15分鐘，以粗口一次性吸管小心吸取離心后的上清液，置于另一潔凈無菌離心管中;(2)、洗滌:將PGE1(1μM)加入到PRP，37℃恒溫箱孵育10分鐘后，配平兩離心管，于24℃（離心機(jī)設(shè)定溫度），500 x g相對離心力離心8分鐘后，取出，以吸管棄去上清液，用改良臺式液以最輕柔的方式將沉于離心管底的血小板懸起;(3

13、)、再洗滌:將(2)中血小板懸液加入PGE1(1μM)孵育后按(2)進(jìn)行，共洗滌2次。
　　 2.1.3血小板鑒定
　　 2.1.3.1光鏡下觀察血小板形態(tài)
　　 主要步驟包括:(1)、全血涂片瑞氏-姬姆薩染色后油鏡下觀察血小板是否活化（形態(tài)改變）;(2)、將PRP涂片瑞氏-姬姆薩染色，油鏡下觀察血小板的形態(tài)及是否有雜細(xì)胞;(3)、洗滌血小板涂片及蓋片光鏡下觀察。
　　 2.1.3.2流式細(xì)胞儀檢測

14、>　　 主要步驟包括:(1)、CD61-FITC與SSLOG圈定血小板，觀察是否有雜細(xì)胞，是否血小板形態(tài)離散;(2)、檢測圈定血小板的CD62P表達(dá)率，檢測人為活化程度;(3)、以凝血酶刺激洗滌血小板檢測血小板活化功能。
　　 2.2流式檢測血小板CD147、CD62P、CD63
　　 2.2.1 ox-LDL刺激
　　 分別以50μg/ml（低濃度組）、100μg/ml ox-LDL（高濃度組）兩種濃度的ox

15、-LDL于37℃水浴箱孵育25分鐘，孵育后均加入抗人CD61-FITC抗體以圈定血小板群，兩種濃度的ox-LDL處理組均分別加入CD62P、CD63、CD147的抗體，暗箱孵育20分鐘后加入臺氏液500μl，立即上機(jī)檢測。對照組加入等體積PBS。各組均設(shè)同型對照，以各抗體的陽性細(xì)胞百分率及CD147相對平均熒光強(qiáng)度為分析指標(biāo)。
　　 2.2.2加入HDL
　　 在另一平行組，加入50μg/ml、100μg/ml ox-L

16、DL兩種濃度的ox-LDL之前的血小板預(yù)先加入HDL(100μg/ml)37℃水浴箱孵育10分鐘后分別加入50μg/ml、100μg/ml ox-LDL，37℃水浴箱孵育25分鐘后分別加入抗體，孵育后上機(jī)檢測。各組均設(shè)同型對照，以各抗體的陽性細(xì)胞百分率及CD147相對平均熒光強(qiáng)度為分析指標(biāo)。對照組加入等體積PBS。
　　 定義相對平均熒光強(qiáng)度為某單克隆抗體的平均熒光強(qiáng)度與其對應(yīng)同型抗體的平均熒光強(qiáng)度之比。
　　 2.3

17、ox-LDL處理血小板后可溶性CD147(sCD147)的檢測
　　 以50μg/ml、100μg/ml ox-LDL干預(yù)25分鐘后的洗滌血小板與對照組（加入PBS的血小板）在24℃環(huán)境相對離心力750 x g下離心20分鐘，小心收集上清液于潔凈EP管中，按人可溶CD147 ELISA檢測說明書操作。
　　 2.4共聚焦顯微鏡(LSM)觀察ox-LDL對血小板形態(tài)的影響
　　 將以50μg/ml、100μg/ml

18、 ox-LDL處理（37℃孵育25分鐘）洗滌血小板與對照組血小板同時加入抗人CD61-FITC抗體（5μl/100μl樣品）后以吸管及硅化玻片涂抹于硅化玻片，加蓋玻片后立即LSM下觀察。
　　 2.5透射電子顯微鏡(TEM)觀察血小板
　　 觀察四組:50μg/ml、100μg/ml ox-LDL處理組、對照組、HDL+50μg/ml處理組
　　 主要步驟:(1)用2％的多聚甲醛+2.5％的戊二醛固定洗滌血小板;

19、(2)新餓酸固定前固定血小板樣品;(3)洗滌;(4)逐級酒精脫水(5)包埋、切片(6)醋酸雙氧鈾，檸檬酸鉛染色(7)上機(jī)鏡檢。
　　 3、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 以上實(shí)驗均重復(fù)至少5次，所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示，不同濃度ox-LDL處理的血小板（對照組、50、100μg/ml ox-LDL）的CD62P、CD63、CD147表達(dá)以O(shè)ne-Way ANOVA分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗（或Dunnett's T3法）行

20、兩兩比較;同等濃度ox-LDL處理的有或無HDL孵育組以配對t檢驗分析。采用SPSS13.0分析軟件分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義
　　 [結(jié)果]
　　 1、Ox-LDL上調(diào)了血小板CD147表達(dá)
　　 50μg/ml、100μg/ml ox-LDL處理后的洗滌血小板CD147陽性細(xì)胞表達(dá)率分別為8.06±3.90％，10.70±3.33％，均明顯高于對照組為0.58±0.31％(P=0.032，0.00

21、6)，而50μg/ml、100μg/ml ox-LDL兩處理組間未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)低、高ox-LDL處理組CD147相對平均熒光強(qiáng)度均高于對照組(P＜0.001)。ELISA檢測經(jīng)ox-LDL刺激后的可溶性CD147表達(dá)可見，高ox-LDL處理組與低ox-LDL處理組未見明顯差異(P=0.272)，但高于對照組(P=0.048)，低ox-LDL處理組與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.243)。TEM觀察到，經(jīng)ox-LDL處理后，

22、血小板發(fā)生了脫顆粒，包括α顆粒的釋放。
　　 2、Ox-LDL促進(jìn)了血小板CD62P、CD63的表達(dá)
　　 50、100μg/ml ox-LDL干預(yù)后的洗滌血小板表達(dá)CD62P均高于對照組(P＜0.001，P=0.004)，而兩處理組間未見統(tǒng)計學(xué)差異，ox-LDL也同樣增加了CD63表達(dá)。CD62P、CD63分別存在于血小板的α顆粒、溶酶體顆粒中，通過TEM觀察也可間接反映ox-LDL促進(jìn)了其釋放。
　　 3、H

23、DL抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的血小板CD147、CD62P、CD63的表達(dá)
　　 預(yù)先以HDL（100μg/ml）孵育洗滌血小板后再分別以ox-LDL(50μg/ml，100μg/ml)處理，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，HDL+50μg/ml ox-LDL組與HDL+100μg/ml ox-LDL組較其對應(yīng)組表達(dá)CD147均有下降(P=0.027，P=0.017)，HDL也表現(xiàn)出抑制了ox-LDL刺激的血小板CD62P與CD63表達(dá)(P均