擬康氏木霉胞外多糖的分離、純化及生物學(xué)活性研究.pdf

1、擬康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)是本實驗室分離并鑒定的一株具有良好生防作用的真菌，本實驗室前期研究表明，其胞外粗多糖可以誘導(dǎo)番茄的抗病性。本研究從擬康氏木霉發(fā)酵液中分離純化出兩種胞外多糖TPeps-1和TPeps-2，測定了TPeps-2的基本結(jié)構(gòu)，并研究了TPeps-2對植物與抗性誘導(dǎo)相關(guān)指標(biāo)的影響及TPeps-1與TPeps-2的體外免疫激活效應(yīng)。 TPeps的分離、純化及結(jié)構(gòu)分析：擬康氏木

2、霉胞外粗多糖經(jīng)葡聚糖凝膠層析得到兩個組分TPeps-1和TPeps-2，經(jīng)HPLC檢測為均一組分：TPeps-2的相對分子量為18325，單糖組成為鼠李糖、葡萄糖和少量的半乳糖，摩爾比為Rha:Glc:Gal=5.6:2.7:1.0，初步分析表明其為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖。 TPeps-2對黃瓜抗性誘導(dǎo)相關(guān)指標(biāo)的影響：經(jīng)0.25mg/mL TPeps-2處理黃瓜葉片后，第1天產(chǎn)生氧爆發(fā)，增幅為同期對照的41.14﹪，第2天為28.05

3、﹪，其后恢復(fù)正常；葉片GSH含量在第2天達(dá)到高峰，為同期對照的將147.85﹪。然后恢復(fù)為正常。HPLC法測定游離態(tài)和結(jié)合態(tài)水楊酸含量，結(jié)果表明局部葉和系統(tǒng)葉中SA與SAG含量均上升，局部葉和系統(tǒng)葉的SA含量在第3天達(dá)到峰值，分別是同期對照的2.4倍和2.2倍；SAG的含量增加要高于SA，局部葉和系統(tǒng)葉中SAG含量在第3天分別比同期對照增加1.7倍和1.5倍。與植物系統(tǒng)抗性相關(guān)酶的活性也受TPeps-2的影響，經(jīng)0.25mg/mL TP

4、eps-2誘導(dǎo)后，β-1,3葡聚糖酶活性從第3天開始明顯增高，在第4天到達(dá)峰值，活性為對照的1.8倍多：幾丁質(zhì)酶活性的變化趨勢與β-1,3葡聚糖酶活性相似，在第3天顯著提高，活性為對照的1.9倍，第4天活性最高，為對照的2.1倍，此后兩種酶活性漸趨回落至正常值。經(jīng)0.25mg/mL TPeps-2誘導(dǎo)，黃瓜葉片中的木質(zhì)素含量在第4天開始明顯增加，含量比同期對照增加69.96﹪，第5天達(dá)到高峰值，含量達(dá)到對照的2.6倍多，然后逐漸下降。以

5、上結(jié)果顯示：TPeps-2增加黃瓜氧自由基的水平，啟動水楊酸信號傳導(dǎo)途徑的植物系統(tǒng)抗性誘導(dǎo)機(jī)制，增強(qiáng)了植物抵御病原生物的能力。 TPeps-2對黃瓜抗旱性的影響：對黃瓜進(jìn)行干旱脅迫，在脅迫第6天丙二醛含量升高，達(dá)到0.732mmol/g.FW，第7天為0.691mmol/g.FW，而經(jīng)0.25mg/mLTPeps-2預(yù)誘導(dǎo)的黃瓜葉片丙二醛含量第6天和第7天則能顯著低于對照，分別比對照低24.45﹪、23.59﹪，達(dá)到顯著性差異(

6、P<0.05)。TPeps-2預(yù)誘導(dǎo)可一定程度上緩解丙二醛的產(chǎn)生，從而對植物起到一定保護(hù)作用。正常情況下黃瓜葉片中游離脯氨酸含量很小，在0.68～0.80mg/g.FW范圍，干旱脅迫的黃瓜葉片中游離脯氨酸含量在第5天開始明顯上升達(dá)0.123mg/g.FW，第6天達(dá)峰值的0.145mg/g．FW。而經(jīng)0.25mg/mLTPeps-2誘導(dǎo)后再干旱脅迫，誘導(dǎo)后第4天即開始顯著增加達(dá)到1.22mg/g.FW，第5天出現(xiàn)峰值達(dá)到1.51m/g.F

7、W，第6天仍有1.43mg/g．FW，顯示經(jīng)TPeps-2預(yù)誘導(dǎo)可以提早產(chǎn)生高濃度脯氨酸，有利于抵抗干旱逆境。TPeps-1和TPeps-2的體外免疫活性：體外脾細(xì)胞增殖實驗顯示TPeps-1和TPeps-2在實驗各濃度下均能極顯著刺激脾細(xì)胞增殖，最低激活濃度僅為25μg/mL，且與ConA具有協(xié)同作用。 TPeps-1和TPeps-2均具有激活巨噬細(xì)胞吞噬活性作用，但TPeps-2比TPeps-1作用要強(qiáng)得多。TPeps-2在

8、各實驗濃度下均具有極顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬活性的作用，TPeps-1僅在25μg/mL、100μg/mL濃度下具極顯著激活作用，25μh/mL作用時TPeps-2活性可達(dá)到對照的2.3倍以上(233.79﹪)，TPeps-1活性僅為對照的1.4倍左右(143.06﹪)。TPeps-2在濃度50μg/mL、25μg/mL還能極顯著提高巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶的活性，分別比對照增加42.70﹪、33.03﹪，提示了TPeps-2能更顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)

9、胞吞噬和清除異物顆粒的能力。 TPeps-1、TPeps-2均能顯著刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)NO，但TPeps-1作用要比TPeps-2作用強(qiáng)。TPeps-1在濃度為25～500μg/mL，范圍內(nèi)具有極顯著刺激產(chǎn)NO效應(yīng)，最高增加值是對照的1.51倍(151.48﹪)，并表現(xiàn)為一定的劑量依賴性，最佳誘導(dǎo)濃度為25p咖L。TPeps-2雖然在實驗設(shè)定7個濃度梯度下均顯示極顯著刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)NO的作用，但增加值僅在47.33﹪～90﹪之間，最