Fcgr3B基因拷貝數(shù)多態(tài)性與腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)相關(guān)性的研究及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、前言：
　　 腎臟移植自從60年代在世界范圍內(nèi)開展以來(lái),因其與透析相比,所受的限制更少,生活的質(zhì)量更高,一直是終末期腎臟病(ESRD)患者腎臟替代治療的最佳選擇。自從各種免疫抑制劑在臨床上的應(yīng)用,使得移植腎的短期及長(zhǎng)期存活率均得到較大的改善。但是移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)一直是移植物的長(zhǎng)期存活的一道障礙。急性排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制具有很大的復(fù)雜性,有眾多因素影響了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生,如群體反應(yīng)性抗體(PRA),冷熱缺血時(shí)間,HLA錯(cuò)配以及

2、新近發(fā)現(xiàn)的MICA(MHC-I類分子相關(guān)相關(guān)抗原A)抗體等均是影響移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生的重要因素。但是,即使在上述影響素相同的個(gè)體中,急性排斥反應(yīng)發(fā)生及移植物的存活仍然存在很大的差別。因此,尋找其他潛在影響急性排斥反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制,從而改善移植物的存活,一直是移植界學(xué)者所追求的目標(biāo)。
　　 基因多態(tài)性與腎移植急性排斥反應(yīng)關(guān)系的研究一直都是學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn),但以往的基因多態(tài)性研究都是以單核苷酸多態(tài)性(SNP)為切入點(diǎn),例如血小板特

3、異性抗原基因,趨化因子基因等。近年來(lái),基因拷貝數(shù)多態(tài)性(CNV)的發(fā)現(xiàn)使得我們對(duì)基因多態(tài)性這一現(xiàn)象有了新的更深入的認(rèn)識(shí),個(gè)體之間的基因差異不再只是幾個(gè)核苷酸堿基的差別,而可能是一整段具有完整功能的基因甚至更長(zhǎng)核苷酸片段的差別。現(xiàn)在,大量的基因拷貝數(shù)多態(tài)性被發(fā)現(xiàn),并且有相當(dāng)大一部分CNV與疾病易感性有著密切聯(lián)系,例如神經(jīng)功能相關(guān)的EFNA5,GLUR7,CACNG2及AKAP5基因拷貝數(shù)多態(tài)性,免疫功能相關(guān)的CCL3,CCL4的基因拷貝數(shù)

4、多態(tài)性等。在2006年Nature雜志上曾報(bào)道,Fcgr3B基因拷貝數(shù)多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)及狼瘡腎炎(LN)的發(fā)病密切相關(guān)。移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)與SLE及許多自身免疫性疾病在發(fā)病機(jī)理上有眾多相似之處,且Fcgr3B基因?qū)?yīng)的蛋白產(chǎn)物FcγⅢB受體在人類主要表達(dá)在中性粒細(xì)胞表面,而中性粒細(xì)胞在移植腎急性排斥活檢標(biāo)本中是一種非常常見炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞。這一系列的關(guān)系,使我們聯(lián)想到Fegr3B基因拷貝數(shù)多態(tài)性可能與腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)

5、的發(fā)生有關(guān)。本研究中,我們探討了Fcgr3B基因拷貝數(shù)多態(tài)性與腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的相關(guān)性并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。
　　 第一部分Fcgr3B基因拷貝數(shù)多態(tài)性與腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)相關(guān)性的研究。
　　 目的：每年終末期腎病(ESRD)患者以7％-8％的比例增加,而腎臟移植是治療ESRD的最佳選擇。隨著新型免疫抑制劑的臨床應(yīng)用,急性排斥發(fā)生率明顯下降,移植物短期存活率明顯提高,但10年存活率在活體及尸體腎移植仍

6、較較低。排斥反應(yīng)仍是腎移植成功的最大障礙。近來(lái)許多研究表明Fegr3B基因拷貝數(shù)多態(tài)性與自身免疫性疾病的發(fā)生存在密切關(guān)系,即低Fcgr3B拷貝數(shù)個(gè)體容易患狼瘡性腎炎,小血管炎等疾病。而在臨床上,許多自身免疫性疾病與腎移植后排異的發(fā)生具有相似的免疫基礎(chǔ)背景。由此,本研究旨在探明Fcgr3B基因拷貝數(shù)變異是否與腎移植急性排斥反應(yīng)存在相關(guān)性。
　　 方法：提取1027例腎移植受者及450例健康人外周血DNA,以Fcgr3B為2拷貝的D

7、NA樣本為標(biāo)準(zhǔn)品,實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測(cè)他們的Fcgr3B基因拷貝數(shù),Sothem Bolt法驗(yàn)證拷貝數(shù)結(jié)果。比較腎移植受者及健康人群、腎移植術(shù)后移植腎功能穩(wěn)定者及急性排斥者、急性排斥者不同病理類型之間的Fcgr3B基因拷貝數(shù)差異。
　　 結(jié)果：在中國(guó)漢族人群中,Fegr3B基因拷貝數(shù)頻數(shù)分布與高加索人群類似,其中腎移植受者中0,1,2,3拷貝的頻數(shù)分別為5.1％,50.2％,38.1％及5.6％；健康人群0,1,2,

8、3拷貝的頻數(shù)分別為2.4％,39％,47.3及6.9％。按照最多見的2拷貝為界,<2拷貝的歸為低拷貝組,≥2拷貝的歸為高拷貝組,健康人群低拷貝數(shù)個(gè)體頻數(shù)明顯低于腎移植受者(P<0.0001,卡方值22.921,95％可信區(qū)間:1.378-2.158)。而在移植腎受者中,移植腎功能穩(wěn)定者0,1,2,3拷貝的頻數(shù)分別為4.3％,48.9％,40.0％,5.6％；急性排斥者0,1,2,3拷貝的頻數(shù)分別為7.9％,55.0％,31.4％,5.2

9、％。急性排斥者低拷貝數(shù)個(gè)體頻數(shù)明顯高于移植腎功能穩(wěn)定者(P=0.009,卡方值6.842,95％可信區(qū)間:0.495-0.905)。按照Banff標(biāo)準(zhǔn)將移植腎急性排斥組分為急性體液性排斥組(C4d+),急性細(xì)胞性排斥組及臨界改變組,就體液性排斥反應(yīng)而言,其在低拷貝排斥著與高拷貝排斥著中的比例分別為19.4％和21.2％,沒有顯著差異(P=0.752).
　　 結(jié)論：中國(guó)漢族人群中Fcgr3B基因低拷貝變異(<2拷貝)個(gè)體更易發(fā)生

10、終末期腎臟病且低拷貝個(gè)體在腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率升高.
　　 第二部分 Fcgr3B基因拷貝數(shù)變異對(duì)腎移植受者中性粒細(xì)胞功能的影響。
　　 目的：Fcgr3B基因?qū)?yīng)的蛋白產(chǎn)物FcγRⅢB是低親和力IgG受體中的一員,它通過(guò)糖基磷脂酰肌醇基序(GPI)錨定于細(xì)胞膜表面,但是并不具有胞內(nèi)段。FcγRⅢB受體只在人類表達(dá),且主要存在與中性粒細(xì)胞膜表面。目前認(rèn)為,FcγRⅢB受體的主要功能是清除免疫復(fù)合物.而拷貝數(shù)變化

11、可以通過(guò)劑量效應(yīng),空間位阻效應(yīng)以及影響調(diào)控元件等多種方式影響表型。本部分研究的目的就是要找出Fcgr3B基因拷貝數(shù)變異影響表型改變的機(jī)制及其對(duì)不同拷貝數(shù)個(gè)體中性粒細(xì)胞功能所產(chǎn)生的影響。
　　 方法：按照拷貝數(shù)分布比例選取高、低拷貝移植腎功能穩(wěn)定的腎移植受者各15例,其中低拷貝組0拷貝4例,1拷貝11例,高拷貝組2拷貝9例,3拷貝5例,4拷貝1例。采用中性粒細(xì)胞分離液分離各拷貝數(shù)受者的中性粒細(xì)胞。我們應(yīng)用流式方法,檢測(cè)了不同拷貝數(shù)

12、腎移植受者中性粒細(xì)胞表面FcγRⅢB受體表達(dá)量。接下來(lái)我們還應(yīng)用無(wú)菌性的免疫徼珠及可溶性免疫復(fù)合物與中性粒細(xì)胞作用后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同拷貝數(shù)個(gè)體中性粒細(xì)胞吞噬功能及呼吸爆發(fā)功能(檢測(cè)H2O2產(chǎn)量)。另外,對(duì)于中性粒細(xì)胞的趨化功能,我們采用的是Transwell趨化小室實(shí)驗(yàn),以IL-8趨化不同拷貝數(shù)中性粒細(xì)胞,觀察他們趨化能力的差別?？紤]到基因拷貝數(shù)變異可能對(duì)自身及其鄰近的基因表達(dá)產(chǎn)生影響,我們還利用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)不同拷貝數(shù)腎移植

13、受者的Fcgr3B、Fcgr2A及Fcgr2B基因mRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。
　　 結(jié)果：我們的實(shí)驗(yàn)分離的中性粒細(xì)胞,其純度和存活率均在95％以上。FcγRⅢB受體在低拷貝腎移植受者中表達(dá)量明顯低于高拷貝者(中性粒細(xì)胞膜表面CD16bFITC平均熒光強(qiáng)度分別為5.61±0.54及12.59±1.33(Mean±SEM),P<0.0001)。而在對(duì)免疫微珠的吞噬、呼吸爆發(fā)以及趨化能力方面,不同拷貝數(shù)腎移植受者的中性粒細(xì)胞間沒有明顯差

14、別。在Fcgr3B及Fcgr2A、Fcgr2B基因mRNA表達(dá)上,我們發(fā)現(xiàn),拷貝數(shù)高低同F(xiàn)egr3B mRNA表達(dá)量相關(guān),高拷貝者mRNA表達(dá)量明顯高于低拷貝者(P<0.0001)。而Fcgr2A基因mRNA表達(dá)水平正好相反,低拷貝組則明顯高于高拷貝組(P=0.0004)。Fcgr2B基因mRNA表達(dá)水平兩組間無(wú)明顯差別(P=0.1026)
　　 結(jié)論： Fcgr3B基因拷貝數(shù)變異同其mRNA表達(dá)及相應(yīng)蛋白產(chǎn)物—FcγRⅢB受體

15、表達(dá)呈正相關(guān),即Fcgr3B對(duì)表性的影響可能是一種劑量效應(yīng)。而這一表型的改變并不影響腎移植受者中性粒細(xì)胞吞噬、呼吸爆發(fā)、及趨化這三種基本的非特異性免疫功能。
　　 第三部分Fcgr3B基因拷貝數(shù)變異與腎移植受者急性排斥反應(yīng)關(guān)系機(jī)理的初步研究。
　　 目的：在我們前期的研究中,我們發(fā)現(xiàn)了低拷貝Fcgr3B的腎移植受者更容易發(fā)生急性排斥反應(yīng)。而中性粒細(xì)胞作為數(shù)量最為龐大的非特異性免疫細(xì)胞,常常被發(fā)現(xiàn)在腎移植急性排斥者的移植腎

16、中浸潤(rùn)。目前的研究越來(lái)越多的表明,中性粒細(xì)胞與移植物急性排斥反應(yīng)有著密不可分的關(guān)系。中性粒細(xì)胞能夠分泌多種趨化因子和細(xì)胞因子,對(duì)T、B淋巴細(xì)胞有非常強(qiáng)的趨化和激活的作用,從而間接加速了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。要尋找中性粒細(xì)胞表面FcγRⅢB受體的基因拷貝數(shù)多態(tài)性與急性排斥反應(yīng)內(nèi)在聯(lián)系的內(nèi)在機(jī)理,我們決定從中性粒細(xì)胞在移植排斥中與T、B淋巴細(xì)胞的關(guān)系,以及中性粒細(xì)胞在移植排斥反應(yīng)中非特異性炎癥因子的變化發(fā)面入手,研究FcγRⅢB受體在這些變化

17、中所扮演的角色,從而找出為什么Fcgr3B低拷貝數(shù)腎移植受者易發(fā)生急性排斥反應(yīng)。
　　 方法：繼續(xù)針對(duì)第二部分的研究對(duì)象,我們利用IFN-γ+TNF-α與不同拷貝數(shù)腎移植受者中性粒細(xì)胞培養(yǎng)12小時(shí),以刺激中性粒細(xì)胞表達(dá)IP-10,Mig,I-TAC,Blys等T、B細(xì)胞的趨化因子和激活因子,采用Real-Time實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法觀察各種因子的表達(dá)在不同拷貝數(shù)間是否存在差異。同時(shí),我們還檢測(cè)了在IFN-γ+TNF-α刺激后其

18、他非特異性炎癥因子(CXCL1、CXCL2、MAC-1、IL-8)的表達(dá)在高低拷貝數(shù)受者間的差異。此外,我們從高地拷貝組中選取了1拷貝和3拷貝腎移植受者各5例,應(yīng)用PI-PLC水解中性粒細(xì)胞膜表面FcγRⅢB受體,抗CD16b單克隆抗體交聯(lián)FcγRⅢB受體兩種方法,減弱和增強(qiáng)FcγRⅢB受體的功能后檢測(cè)了IP-10,Mig,I-TAC mRNA表達(dá)在增強(qiáng)或者減弱前后的變化。
　　 結(jié)果：不同拷貝數(shù)腎移植受者中性粒細(xì)胞在接受IFN

19、-γ+TNF-α刺激12小時(shí)后,上述細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)均有不同程度的升高。而其中IP-10,Mig,I-TAC這三種T細(xì)胞相關(guān)趨化因子在低拷貝受者中上升的幅度明顯高于高拷貝受者上升的幅度(P值分別為0.0211,0.0321,0.0183).而B細(xì)胞活化因子BLys,粘附分子CXCL1、CXCL2、MAC-1及趨化因子IL-8在高低拷貝組間沒有明顯差異。而在PI-PLC水解中性粒細(xì)胞膜表面FcγRⅢB受體后,中性粒細(xì)胞膜表面Fcγ

20、RⅢB受體表達(dá)隨著PI-PLC濃度的升高而逐漸降低,而上述三種T細(xì)胞相關(guān)的趨化因子隨著PI-PLC濃度的升高而升高。在抗CD16b單克隆抗體與中性粒細(xì)胞膜表面FcγRⅢB受體結(jié)合后,三種趨化因子的表達(dá)較結(jié)合前都有所下降,其中,在低拷貝組中,Mig的表達(dá)及I-TAC的表達(dá)在抗體結(jié)合后下降達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.0434及P=0.0457,而高拷貝組中,IP-10的表達(dá)在抗體結(jié)合后下降達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0376)