脯氨酰羥化酶3對肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的增殖和凋亡作用.pdf

1、[目的]
　　構(gòu)建脯氨酰羥化酶3(Porlyl hydroxylase domain3，PHD3)真核表達(dá)載體及探討重組質(zhì)粒對肝癌HepG2細(xì)胞株生長和凋亡的作用，為進(jìn)一步研究PHD3對肝癌可能的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　[方法]
　　1.PHD3基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　根據(jù)GenBank提供的PHD3基因的mRNA序列(登錄號:NM_022073)，設(shè)計一對含有HindⅢ/XhoⅠ酶切位點特異性引物，用R

2、T-PCR法擴(kuò)增PHD3的(CodingDNA sequences，CDS)區(qū)，克隆至pMD(@)19-T simple vector載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli.DH5α中擴(kuò)增，以HindⅢ/XhoⅠ雙酶切電泳鑒定篩選出陽性克隆，進(jìn)行序列測定。再將其亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，轉(zhuǎn)化至宿主菌大腸桿菌E.coli.DH5α中擴(kuò)增。提取陽性重組體質(zhì)粒，進(jìn)行HindⅢ/XhoⅠ雙酶切電泳鑒定與測序分析證實。
　　

3、2.PHD3基因在人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞表達(dá)及影響
　　(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及檢測PHD3基因的表達(dá)
　　采用陽性脂質(zhì)體LipofectamineTM2000包裝pcDNA3.1(+)-PHD3重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒pcDNA3.1(+)瞬時轉(zhuǎn)染到肝癌HepG2細(xì)胞中。命名轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-PHD3組（縮寫為PHD3），轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)組（縮寫為PC3.1）;另設(shè)LipofectamineTM2000處理對照組

4、(縮寫為LP2000)，非處理正常組(縮寫為Normal)。轉(zhuǎn)染48 h后抽取各組總RNA和總蛋白，通過Real time RT-PCR法和Western blot法檢測PHD3的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　(2)效應(yīng)指標(biāo)的檢測
　　1) PHD3對HIF-2α mRNA表達(dá)的影響。
　　2) PHD3對VEGF mRNA表達(dá)的影響。
　　3) PHD3對HepG2細(xì)胞增殖的影響。
　　4) PHD3對He

5、pG2細(xì)胞凋亡作用分析。
　　[結(jié)果]
　　1.pcDNA3.1(+)-PHD3的構(gòu)建和鑒定
　　從胎盤組織提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得約721 bp的PHD3基因cDNA。運用TA克隆法插入pMD(@)19-T simple vector中，基因測序結(jié)果與GenBank提供的PHD3基因的mRNA序列(NM022073)高度同源。pcDNA3.1(+)-PHD3重組體經(jīng)HindⅢ/XhoⅠ雙酶切電泳與測序證實

6、真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PHD3的表達(dá)檢測
　　(1) Real time RT-PCR結(jié)果顯示PHD3組(79.240±5.487) PHD3 mRNA的表達(dá)水平顯著高于Normal組(1.000±0.000)、LP2000組(0.808±0.120)和PC3.1組(0.643±0.122)，均P=0.000。
　　(2) Westem blot結(jié)果顯示，PHD3組(2.285±0.208) PHD

7、3蛋白的表達(dá)水平顯著高于Normal組(0.817±0.036)、LP2000組(0.873±0.071)和PC3.1組(0.965±0.082)，均P=0.000。
　　3.PHD3基因?qū)IF-2α和VEGF的影響
　　(1) PHD3對HIF-2α mRNA表達(dá)影響
　　Real time RT-PCR結(jié)果顯示，PHD3組(1.020±0.046) HIF-2α mRNA的表達(dá)水平與Normal組(1.000±0

8、.000)比較、LP2000組(1.011±0.016)和PC3.1組(1.028±0.059)，P值分別是0.549、0.782和0.798。
　　(2) PHD3對VEGF mRNA表達(dá)影響
　　Realtime RT-PCR結(jié)果顯示，PHD3組(0.983±0.007) VEGF mRNA的表達(dá)水平與Normal組(1.000±0.000)、LP2000組(1.029±0.060)和PC3.1組(0.996±0.012

9、)比較，P值分別是0.535、0.107和0.629。
　　4.細(xì)胞增殖試驗
　　MTT結(jié)果顯示:隨著培養(yǎng)時間的延長，PHD3組細(xì)胞生長速度明顯慢于其他對照組(F=857.926，P=0.000)，表明實驗組細(xì)胞生長受到抑制。
　　5.PHD3對HepG2細(xì)胞的凋亡分析
　　Western blot結(jié)果顯示，PHD3組(1.725±0.051)活化的Caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著高于Normal組(0.53