胚胎后腎間充質(zhì)細胞腎包膜下移植對急性腎小管壞死的保護作用.pdf

1、研究背景 急性腎衰竭(Actue Renal Failure，ARF)是一種病因復(fù)雜的臨床綜合征，病死率高達50﹪～80﹪。ARF最常見的病因為急性腎小管壞死(Acute Tubular Necrosis，ATN)，約占ARF的75﹪～80﹪。近20年來，盡管在支持治療、腎臟替代治療等方面取得了巨大的進展，但目前ATN仍缺乏特異性的治療方法<'[1]>。近年來，細胞移植替代器官移植是目前移植及再生醫(yī)學(xué)中非常熱門的研究，如將骨骼肌

2、細胞直接注入心肌梗死后的組織，神經(jīng)元細胞注入帕金森患者的大腦，臨床上均可見患者的部分功能得到恢復(fù)。尤其在神經(jīng)領(lǐng)域，目前已證實這種移植治療能夠重建或修復(fù)受損的神經(jīng)通路。腎小管是腎臟最容易遭受缺血、中毒、炎癥等損傷的部位，腎小管上皮細胞在急性損傷后本身有一定的修復(fù)和再生能力，有研究認為小管上皮細胞增生時去分化成表型為胚胎/間充質(zhì)性質(zhì)的細胞是修復(fù)過程中關(guān)鍵的一步，增生的小管細胞遷移至損傷部位，取代壞死細胞，從而起到修復(fù)壞死小管，改善腎功能的作

3、用。然而這種再生能力很大程度上取決于腎臟是否有足夠多的新生細胞來取代損傷和死亡細胞，這正是目前阻礙愈合的最關(guān)鍵因素。因此，我們設(shè)想壞死的腎小管通過外源性的補充足夠多的具有分化能力的腎臟干細胞/祖細胞來替代、修復(fù)或改善受損的小管，即采用細胞再生技術(shù)治療ATN，為臨床提供強有力的實驗依據(jù)。胚胎后腎間充質(zhì)細胞(Metanephric Mesenchyme Cells，MMCs)是具有發(fā)育的多能性及自我更新能力的胚胎期腎臟干細胞，已證實單一的后

4、腎間充質(zhì)細胞就能產(chǎn)生除集合管以外的腎單位的所有上皮細胞，包括腎小管上皮細胞，即MMCs就是腎上皮前體細胞(MM-Epithelial Cell Precursor，MM-Ep)。將這種極具潛力的腎臟干細胞采用有效的方法導(dǎo)入體內(nèi)發(fā)揮作用同樣受到人們的關(guān)注。很多研究發(fā)現(xiàn)腎包膜下的微環(huán)境適宜胚胎后腎的發(fā)育、成熟。腎包膜下有豐富的血管床，注射的細胞能夠很快的被周圍的血管吸收入腎實質(zhì)?；谝陨细鞣矫娴难芯?，為探討MMCs 對急性腎小管損傷的再生修

5、復(fù)作用，并為臨床ATN治療探索一條新的途徑，本研究以大劑量慶大霉素誘導(dǎo)建立腎毒性急性腎小管壞死模型，同時腎包膜下移植一定數(shù)量的MMCs，通過體內(nèi)示蹤、檢測腎功能、尿NAG酶等生化指標(biāo)、腎臟形態(tài)學(xué)指標(biāo)，以及對腎臟腎小管上皮細胞的增生、凋亡的研究，探討MMCs對ATN大鼠腎臟的保護作用。研究目的體外培養(yǎng)和擴增MMCs后，將MMCs移植到大鼠腎包膜下，探討移植細胞對宿主急性腎小管損傷的再生修復(fù)作用及對腎小管上皮細胞凋亡的影響。 研究方

6、法 (1)胚胎后腎間充質(zhì)細胞體外培養(yǎng)及擴增實驗本實驗所用的胚胎后腎間充質(zhì)細胞RIMM-18細胞系，由美國馬里蘭州弗雷德里克國家健康研究所Levashova博士惠贈，已證實具有干細胞樣特性。①RIMM-18細胞系復(fù)蘇、培養(yǎng)及擴增復(fù)蘇：37℃水浴箱快速復(fù)溫，洗滌細胞——用吸管吸出細胞后，離心，加10倍以上的培養(yǎng)基混合后再離心，棄上清液，重復(fù)洗一次。培養(yǎng)：RIMM-18細胞培養(yǎng)所用的完全培養(yǎng)基為DMEM/F12+5﹪胎牛血清+堿性成纖

7、維細胞生長因子(10ne/mL)+17β-雌二醇(100nmol/L)，37℃、5﹪CO<,2>、飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)， 2～3天換液1次。傳代：D-Hank's液洗滌細胞2次，1Inl 0.25﹪胰酶/0.02﹪EDTA(1：1)混合消化液消化約3～5分鐘，將細胞輕輕吹打成單細胞懸液，完全培養(yǎng)基終止消化，細胞計數(shù)板計數(shù)，以10<'4>個/mL傳代。②體外示蹤實驗(DAPI標(biāo)記MMCs)：傳代細胞長滿后，培養(yǎng)液中加入DAPI(終濃度50

8、μg/mL)孵育40分鐘后，D-Hank's液反復(fù)洗滌細胞7次，以去除未與細胞結(jié)合的DAPI。分別于標(biāo)記后40分鐘、5 d、8d、11d、14d在熒光鏡下觀察細胞。③RIMM-18細胞系鑒定：倒置顯微鏡下及H.E、Giemsa染色觀察細胞形態(tài)，免疫細胞化學(xué)染色法行生物學(xué)特性的鑒定。 (2)胚胎后腎間充質(zhì)細胞右腎包膜下移植對急性腎小管壞死保護作用的實驗研究 167只8～10周齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠按隨機數(shù)字

9、法分為5組：①正常對照組(Control，Control組)：不做任何處理；②急性腎小管壞死(Acute Tubular Necrosis，ATN組)：以慶大霉素200mg/(kg.d)連續(xù)4天皮下注射，誘導(dǎo)建立大鼠急性腎小管壞死模型；③ATN加假手術(shù)組(Acute Tubular Necrosis plus ShamOperation，ATN+Sham組)：慶大霉素200mg/(kg.d)連續(xù)4天皮下注射，注射第1天同時右腎包膜下多點

10、注射0.2mL生理鹽水；④ATN加培養(yǎng)基組(Acute Tubular Necrosis plus Media，ATN+Med組)：慶大霉素200mg/(kg.d)連續(xù)4天皮下注射，注射第1天同時右腎包膜下多點注射0.2mL無血清培養(yǎng)基；⑤ATN加細胞移植組(Acute TubularNecrosis plus Celluar Transplantation，ATN+Cell 組)：慶大霉素200mg/(kg.d)連續(xù)4天皮下注射，注射

11、第1天同時右腎包膜下多點注射0.2mL細胞(細胞濃度約5x10<'7>個/mL，無血清培養(yǎng)基稀釋)。每組均為4天成模，慶大霉素注射后第5、8、11、14天(即成模后第1、4、7、10天)每組分別取6只老鼠處死，為觀察熒光分布，AT+Cell組還在注射第2天處死6只大鼠，處死前均稱重、留24小時尿液，采集血以及腎組織標(biāo)本，檢測不同時間點以下指標(biāo)：①體內(nèi)示蹤實驗；②檢測血及尿腎功能生化指標(biāo)；③腎組織形態(tài)學(xué)改變及病理評分；④免疫組化法檢測腎小

12、管上皮細胞增生標(biāo)志物Ki-67，計算增殖指數(shù)。 (3)胚胎后腎間充質(zhì)細胞對腎小管壞死后細胞凋亡的影響動物實驗分組及處死大鼠的時間同第2部分，各實驗組大鼠檢測以下指標(biāo)：①末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TDT-mediateddUTP-biotin Nick End-Labeling，TUNEL)檢測腎皮質(zhì)凋亡細胞；②RT-PCR方法檢測大鼠腎皮質(zhì)Bcl-2mRNA表達；③免疫組化方法檢測腎皮質(zhì)凋亡相關(guān)因子Bcl-2蛋白表

13、達水平。 研究結(jié)論 (1)RIMM-18細胞系體外培養(yǎng)及擴增后仍然保持間充質(zhì)干細胞特性。 (2)急性腎小管壞死大鼠右腎包膜下移植胚胎后腎間充質(zhì)細胞后，移植細胞能夠向損傷的腎小管部位遷移，腎功能及腎臟病理改善，腎小管上皮細胞增殖明顯，從而促進了腎小管結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)，降低了ATN大鼠死亡率。 (3)胚胎后腎間充質(zhì)細胞移植后，腎皮質(zhì)Bcl-2mRNA和蛋白水平上調(diào)，這可能是其促進腎小管上皮細胞再生修復(fù)的機制之