人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠急性腎損傷及其慢性化的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、隨著人口老化、侵入性檢查增多、造影劑和化療藥物的廣泛使用，住院病人急性腎損傷（Acute Kidney Injury，AKI）的發(fā)病率和死亡率逐年增高。既往認(rèn)為AKI后腎臟功能可以恢復(fù)正常，不影響腎臟壽命。但流行病學(xué)研究表明，即使是腎功能恢復(fù)正常的AKI患者，10年內(nèi)仍有約25％進(jìn)展為慢性腎臟病（Chronic Kidney Disease， CKD），死亡風(fēng)險(xiǎn)增加50%。因此，AKI與CKD被認(rèn)為是相互交聯(lián)的綜合征。目前臨床尚無(wú)有效方

2、法阻遏AKI向CKD的進(jìn)展。
　　研究表明，外源性間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells， MSCs）治療可以減輕順鉑、甘油以及缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）誘導(dǎo)的小鼠AKI。但該細(xì)胞對(duì)急性腎損傷慢性化的效應(yīng)目前研究較少，且文獻(xiàn)中使用的細(xì)胞多為骨髓來(lái)源。脂肪來(lái)源MSCs方便獲取，且有比骨髓來(lái)源MSCs更強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力，因此本研究采用了人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（human Adip

3、ose-Derived Mesenchymal Stem Cells, hAD-MSCs）進(jìn)行相關(guān)研究。
　　研究表明，AKI后腎小管上皮細(xì)胞（Tubular Epithelial Cells, TECs）的Sox9被明顯激活，且有超過(guò)40%的Sox9陽(yáng)性細(xì)胞也是Ki67陽(yáng)性的，因此Sox9的激活促進(jìn)了損傷TECs的內(nèi)源性修復(fù)。鑒于，MSCs和Sox9都有促進(jìn)AKI修復(fù)與再生的能力，我們猜想hAD-MSCs可能通過(guò)旁分泌外泌體，進(jìn)

4、而激活TECs中Sox9的表達(dá)，減輕AKI及其慢性化。本研究中，我們成功建立了小鼠單側(cè)I/R模型，尾靜脈注射體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的hAD-MSCs，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞促進(jìn)了TECs中Sox9的激活，明顯減輕AKI及其慢性化；我們同時(shí)提取了hAD-MSCs的外泌體，發(fā)現(xiàn)其外泌體有同細(xì)胞相似的保護(hù)作用，而使用抑制外泌體釋放的藥物則阻斷了Sox9的激活，抑制了該保護(hù)效應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)hAD-MSCs的保護(hù)作用是通過(guò)旁分泌效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的；我們?cè)隗w外將
　　

5、hAD-MSCs或其外泌體同TECs及胚胎成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)hAD-MSCs可以激活TECs中Sox9的表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)化生子因子-β1（Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1）誘導(dǎo)的TECs向促纖維化表型的轉(zhuǎn)變，抑制外泌體的釋放則阻斷該效應(yīng)；但hAD-MSCs對(duì)胚胎成纖維細(xì)胞激活為肌成纖維細(xì)胞則無(wú)明顯抑制作用。綜上所述，hAD-MSCs通過(guò)旁分泌外泌體，激活TECs中Sox9的表達(dá)，促進(jìn)腎臟的修復(fù)與

6、再生，進(jìn)而阻遏AKI及其慢性化的進(jìn)展。
　　第一部分 hAD-MSCs減輕急性腎損傷并促進(jìn)腎臟修復(fù)
　　目的：觀察hAD-MSCs治療小鼠單側(cè)腎臟I/R5天后腎臟病理、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、損傷及修復(fù)相關(guān)因子的表達(dá)情況，探討hAD-MSCs對(duì)I/R誘導(dǎo)的小鼠AKI的保護(hù)效應(yīng)及可能的作用機(jī)制。
　　方法：構(gòu)建 C57BL/6小鼠左側(cè)腎臟 I/R模型，24小時(shí)后尾靜脈注射體外擴(kuò)增的hAD-MSCs，5天后取腎臟和外周血標(biāo)本。檢測(cè)指

7、標(biāo)如下：
　　1）腎臟病理：肉眼觀察皮髓交界處缺血帶的變化，PAS染色觀察腎臟病理的改變；
　　2）損傷相關(guān)分子：免疫熒光觀察腎臟損傷分子（Kidney Injury Molecule-1，Kim-1）的表達(dá)；
　　3）修復(fù)相關(guān)因子：免疫熒光觀察殘存近端小管（LTL）的數(shù)目、小管上皮細(xì)胞Sox9的激活情況；
　　4）炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的變化（巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞）；
　　5）T

8、ECs的增殖和凋亡：免疫熒光雙染（Ki67和Vimentin）檢測(cè)TECs的有效增殖；TUNEL熒光觀察TECs凋亡的變化，Western Blot（WB）檢測(cè)腎臟Bcl-2、Bax的表達(dá)；
　　6）AKI-CKD標(biāo)記物：熒光雙染檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞G2/M期阻滯（PH3和Ki67），熒光檢測(cè)管周毛細(xì)血管網(wǎng)（CD31），WB檢測(cè)腎臟缺氧誘導(dǎo)因子（Hif-1α）的變化。
　　結(jié)果：與 I/R組相比較，hAD-MSCs治療后腎臟缺

9、血帶縮小、病理?yè)p傷減輕；Kim-1的表達(dá)減少；殘存的TECs增多，TECs上Sox9的表達(dá)增加；腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；TECs凋亡減少、有效增殖增加；阻滯于G2/M期的TECs明顯減少，管周毛細(xì)血管網(wǎng)密度增大，腎臟缺氧改善。
　　結(jié)論：hAD-MSCs治療減輕了缺血再灌注所致的小鼠急性腎損傷，并促進(jìn)腎臟的修復(fù)。該作用可能是由于 hAD-MSCs治療減少了腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞有效增殖，減輕細(xì)胞周期阻滯，改善了腎臟缺血

10、缺氧的微環(huán)境所產(chǎn)生的。
　　第二部分 hAD-MSCs減輕I/R誘導(dǎo)的慢性腎間質(zhì)纖維化
　　目的：觀察hAD-MSCs治療小鼠單側(cè)腎臟I/R28天后腎臟膠原纖維沉積、纖維化相關(guān)因子的表達(dá)變化，探討hAD-MSCs對(duì)單側(cè)腎臟I/R誘導(dǎo)的小鼠慢性腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)效應(yīng)及可能的作用機(jī)制。
　　方法：構(gòu)建 C57BL/6小鼠左側(cè)腎臟 I/R模型，24小時(shí)后尾靜脈注射體外擴(kuò)增的hAD-MSCs，28天后取腎臟標(biāo)本。檢測(cè)指標(biāo)如下：

11、
　　1）腎臟大?。喝庋塾^察腎臟大小的變化，計(jì)算腎臟重量的差值（右側(cè)腎重減去左側(cè)腎重）；
　　2）損傷相關(guān)分子：免疫熒光觀察腎臟損傷分子（Kim-1）的表達(dá)；
　　3） Sox9：免疫熒光觀察TECs中Sox9的表達(dá)；
　　4）間質(zhì)膠原纖維沉積：Masson和天狼星紅染色觀察腎臟膠原纖維沉積的變化；
　　5）纖維化相關(guān)因子：免疫熒光檢測(cè)α-SMA、Col-Ⅳ的表達(dá)變化，WB檢測(cè)α-SMA、PDGFR-β的表

12、達(dá)變化；RT-PCR檢測(cè)α-SMA、PDGFR-β、Col-Ⅳ以及Fibronectin的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：與 I/R組相比較，hAD-MSCs治療后左側(cè)腎臟體積增大，右側(cè)與左側(cè)腎臟的差值減??；腎臟損傷減輕；腎間質(zhì)膠原纖維沉積減少，纖維化相關(guān)因子的表達(dá)減少。
　　結(jié)論： hAD-MSCs治療減輕了缺血再灌注誘導(dǎo)的小鼠慢性腎間質(zhì)纖維化。該作用可能是由于hAD-MSCs治療明顯減輕了急性期腎臟的損傷，使更多受損的TECs在急

13、性期得以修復(fù)，重新進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行增殖；hAD-MSCs治療后急性期腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，炎性細(xì)胞因子和趨化因子的分泌也減少，間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的激活隨之減少。故而進(jìn)入慢性期的損傷細(xì)胞數(shù)目明顯減少，腎間質(zhì)纖維化得以減輕。
　　第三部分 hAD-MSCs通過(guò)其外泌體激活腎小管上皮細(xì)胞Sox9的表達(dá)
　　目的：觀察hAD-MSCs來(lái)源外泌體對(duì)腎小管上皮細(xì)胞 Sox9的表達(dá)、纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響，深入探討hAD-MSCs治療急

14、性腎損傷及其慢性化的機(jī)制。
　　方法：體內(nèi)：構(gòu)建C57BL/6小鼠左側(cè)腎臟I/R模型，24小時(shí)后尾靜脈注射hAD-MSCs來(lái)源的不同濃度的外泌體，加或不加抑制外泌體釋放的藥物（GW4869），7天后取腎臟標(biāo)本。
　　1）細(xì)胞示蹤：PKH-26染色hAD-MSCs、GFP小鼠提取mAD-MSCs，分別經(jīng)尾靜脈注射入I/R小鼠體內(nèi)，檢測(cè)帶熒光的細(xì)胞；
　　2）分化：熒光雙染（GFP和LTL），觀察有無(wú)LTL陽(yáng)性的GFP細(xì)胞

15、；
　　3）外泌體的鑒定：WB檢測(cè)外泌體膜表面分子CD63的表達(dá)，電鏡檢測(cè)外泌體的大小和形態(tài)；
　　4）外泌體的濃度：尾靜脈注射 hAD-MSCs來(lái)源的外泌體，摸索出能使腎臟纖維化水平降低的外泌體的最適濃度；
　　5）纖維化相關(guān)因子：WB檢測(cè)α-SMA、PDGFR-β的表達(dá)變化；
　　6） Sox9：免疫熒光檢測(cè)腎組織中Sox9的表達(dá)變化；熒光雙標(biāo)（Sox9和Kim-1）檢測(cè)損傷管的修復(fù)情況，熒光雙標(biāo)（Sox9與

16、LTL）檢測(cè)殘存管的變化。
　　體外：將hAD-MSCs或者其外泌體同TGF-β1處理的原代TECs或胚胎成纖維細(xì)胞系（NIH3T3）進(jìn)行共培養(yǎng)，加或不加GW4869。
　　1）纖維化相關(guān)因子： WB檢測(cè)hAD-MSCs對(duì)TGF-β1刺激的TECs、NIH3T3細(xì)胞系促纖維化因子（α-SMA、Col-Ι、Fibronectin）表達(dá)的影響；PCR檢測(cè)hAD-MSCs對(duì)TGF-β1刺激的TECs、NIH3T3細(xì)胞系纖維化相關(guān)因

17、子（TGF-β1、CTGF、α-SMA、Col-Ι、Fibronectin）分泌的影響。
　　2） Sox9： PCR檢測(cè)hAD-MSCs對(duì)TGF-β1刺激的TECs、NIH3T3細(xì)胞系Sox9表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：體內(nèi)：在hAD-MSCs治療后的腎臟中僅找到少數(shù)帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞，這些細(xì)胞并未分化為腎小管上皮細(xì)胞。與I/R組相比較，hAD-MSCs來(lái)源的外泌體治療后腎小管上皮細(xì)胞Sox9的激活增加，腎間質(zhì)纖維化減輕，呈劑