VEGF基因轉染促進人早胚間充質(zhì)干細胞修復急性腎損傷的作用研究.pdf

1、目的:急性腎損傷(AKI)是臨床的常見疾病，重癥死亡率達50％-80％。雖然在急性腎衰竭的發(fā)病機制和治療上進行了諸多研究，但是到目前為止治療的手段仍然有限，唯一可選擇的治療方法為透析治療和在等待腎功能恢復過程中的支持治療，尋找更有效地治療AKI的方法一直是努力的方向。
　　 干細胞的定義為具有自我更新和多向分化潛能的克隆細胞，干細胞在治療急性腎損傷方面有廣闊的前景，已有多項研究證實干細胞對于急性腎損傷有治療作用。MSC是目前最常

2、用于研究發(fā)育以及疾病治療的干細胞，其中又以成體骨髓來源MSC最為多見，隨著研究的深入，MSC的來源日益增多，比如成體或者胚胎，胎兒組織，臍血等。由于干細胞的來源不同，各自分化，增生能力亦有差別，到目前為止尚不知道何種干細胞作為治療疾病或新藥研究是最佳的。成體骨髓MSC來源廣泛，但是使用這一細胞也有其局限性，MSC在成人骨髓內(nèi)含量極低，約占有核細胞數(shù)的0.001-0.0001％，并且骨髓MSC的數(shù)量和分化能力隨著所以年齡的增長而減少和減弱

3、。與成體MSC相比，胚胎組織來源的MSC增殖和分化能力強，免疫原性弱，所以使用胚胎來源干細胞作為干細胞的研究有其獨特的優(yōu)越性。目前從人早期胚胎中分離MSC的研究國內(nèi)外研究較少。
　　 關于干細胞修復急性腎損傷的機制以往認為是通過直接轉化為小管上皮細胞，目前認為小管再生主要通過殘存細胞的增生和轉分化，僅有很少的外源干細胞轉化為腎小管上皮細胞。MSC的腎保護作用主要通過旁分泌作用，分泌細胞因子抗調(diào)亡，促分裂，免疫調(diào)節(jié)和促血管生成。通

4、過對干細胞的旁/自分泌作用的深入了解，將以干細胞分泌功能作為調(diào)節(jié)干細胞保護的新靶點提供依據(jù)。
　　 VEGF是血管內(nèi)皮細胞特異性有絲分裂原，具有促進血管內(nèi)皮細胞分裂增殖、促進新生血管形成和側支循環(huán)開放等作用。VEGF對于維持腎小球功能起關鍵作用，可以刺激間質(zhì)血管生成，小管增值并且直接保護腎臟上皮細胞。最近有研究MSC經(jīng)過RNA干擾后VEGF表達下降，急性缺血再灌注小鼠給予干擾后MSC后，與給予干擾MSC的小鼠比，腎臟修復明顯減低

5、，生存率下降，這說明，VEGF是MSC腎臟保護作用中重要的因子。
　　 因此我們準備以調(diào)節(jié)干細胞分泌VEGF為切入點，提高干細胞對AKI的治療效果。本實驗采用體外順鉑損傷腎小管上皮細胞模型和體外順鉑誘導的裸鼠急性腎損傷模型觀察VEGF基因轉染對于hMSC修復急性腎損傷的作用，并對其機制進行探討。
　　 方法：
　　 一、VEGF基因轉染人早胚間充質(zhì)干細胞
　　 選擇攜帶VEGF165基因的重組腺病毒(Ad

6、.VEGF165病毒顆粒由張裕東博士饋贈)轉染hMSC，并使用攜帶GFP基因的重組腺病毒轉染hMSC確定最佳的轉染滴度。
　　 實驗結果顯示：腺病毒介導的GFP基因?qū)τ趆MSC具有較高的轉染效率，轉染效率與病毒滴度(MOI)具有量效關系。病毒MOI為50時，轉染效率＞70％，轉染后hMSC的生長曲線與未轉染細胞相似。轉染VEGF后，hMSC可有效表達VEGF,4-6天時達峰，14天左右恢復正常。
　　 腺病毒介導的VEG

7、F基因可以安全、有效的轉染hMSC，其攜帶的VEGF基因可獲得較高的表達水平。
　　 二、VEGF基因轉染的hMSC對順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷的修復作用
　　 使用10 uM順鉑預處理TCMK-1后24小時，TCMK-1分為正常組、hMSC+順鉑+TCMK-1共培養(yǎng)組、VEGF轉染hMSC+順鉑+TCMK-1共培養(yǎng)組、空載體轉染hMSC+順鉑+TCMK-1共培養(yǎng)組和順鉑+TCMK-1組。結果顯示：與正常組相比，TCM

8、K-1經(jīng)過順鉑預處理后3天增值明顯減慢，凋亡增加，PCNA表達增強(p＜0.01)。與未共培養(yǎng)組相比，順鉑預處理后TCMK-1與各干細胞共培養(yǎng)均能緩解順鉑對TCMK-1的生長抑制，減少凋亡，促進PCNA的表達(p＜0.01)；尤其以VEGF轉染hMSC共培養(yǎng)組最明顯(p＜0.01 versus cisplatin+TCMK-1+AD-hMSC，cisplatin+TCMK-1+hMSC)。
　　 本部分實驗證實：VEGF轉染hM

9、SC和以提高hMSC對順鉑損傷TCMK-1的修復作用，機制可能與增加hMSC促增殖和抗調(diào)亡有關。
　　 三、VEGF基因轉染的hMSC對順鉑誘導的小鼠AKI的修復作用
　　 選取6-8周齡的BALB/C雄性裸鼠，按18mg/kg經(jīng)小鼠腹腔注射順鉑，建立藥物性急性腎損傷小鼠模型。動物分組：A組(正常對照組)；B組(生理鹽水治療組)：注射生理鹽水；C組(VEGF-hMSC組)：注射體外轉染Ad.CMV-VEGF165的hMS

10、C；D組(AD-hMSC)：注射體外轉染Ad.CMV-con的hMSC；E組(hMSC組)：注射hMSC。藥物注射后第4天，小鼠腎臟病理解剖結果腎小管上皮細胞呈空泡變性，部分細胞壞死脫落入管腔，基底膜暴露；小鼠血中BUN，SCr升高。C組、D組和E組HE染色壞死小管計數(shù)，管型計數(shù)以及血清BUN，SCr均低于B組，以C組的檢測指標降低最明顯。與正常腎臟相比急性腎損傷后各組中腎臟PANC和TUNEL染色計數(shù)增加，C組、D組和E組PCNA計數(shù)

11、均高于B組而TUNEL計數(shù)低于B組，其中C組的PCNA計數(shù)最高，TUNEL計數(shù)最低。與正常腎臟相比急性腎損傷后各組中腎臟腎小管周圍CD34染色血管面積減少，C組、D組和E組CD34染色血管面積均高于B組，其中C組染色面積最高。PKH-26標記的hMSC大多定位于肺、肝、脾，腎臟僅看到很少量的干細胞，并且在VEGF轉染和非轉染組沒有區(qū)別。
　　 在本部分實驗中，我們成功的建立了順鉑誘導的急性腎損傷裸鼠模型，VEGF基因轉染可以提高

12、hMSC對急性腎損傷的修復作用，具體機制與VEGF基因轉染可以提高干細胞的促增值，抗凋亡和保護血管微環(huán)境的作用有關。
　　 結論:
　　 綜合三部分結果，我們可以得出結論，使用VEGF腺病毒基因轉染可以有效上調(diào)hMSC的VEGF水平。上調(diào)hMSC的VEGF水平可以增加hMSC的對受損腎小管上皮的保護作用，其機制與增加干細胞的促增值，抗凋亡和保護血管內(nèi)皮功能有關。本研究為臨床使用新的干細胞來源提供了基礎，驗證了關于提高干細