胚胎后腎間充質(zhì)細胞尾靜脈移植對慢性血清病腎炎大鼠腎損傷的修復(fù)研究.pdf

1、目的：分離、培養(yǎng)大鼠脾臟T細胞、胚胎后腎間充質(zhì)細胞，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓源性樹突細胞，為后續(xù)體外模擬胚胎后腎間充質(zhì)細胞的免疫調(diào)節(jié)作用、細胞移植研究提供細胞來源及依據(jù)。
　　 方法：(1)健康SD雌性大鼠，10％水合氯醛麻醉后無菌條件下取出股骨和脛骨，并進行免疫表型鑒定。(2)取SD大鼠，麻醉后無菌條件下取脾，研磨成脾細胞懸液，密度梯度離心取單核細胞層，以RPMI1640基本培養(yǎng)基制成2×106/ml淋巴細胞懸液，置37℃、體積分數(shù)為

2、0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)，并進行流式細胞檢測。(3)孕14天大鼠胚胎，分離胚胎腎臟，去除輸尿管芽，消化后置37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取傳至第3代的MMS倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞，并行HE染色、電鏡觀察、生長曲線測定；ABC免疫酶染色法檢測波形蛋白、角蛋白、nestin、CD133、CD34。另取傳12代細胞及凍存復(fù)蘇后細胞培養(yǎng)，形態(tài)觀察，并波形蛋白、角蛋白檢測。
　　 結(jié)果：(1)骨髓單個核細胞誘導(dǎo)后呈現(xiàn)

3、典型樹突細胞形態(tài)，表現(xiàn)為毛刺狀突起、半貼壁生長，并表達CD11C、CD86、MHC-Ⅱ等樹突細胞表面標志。(2)由脾臟分離的T淋巴細胞，經(jīng)流式細胞儀檢測，CD3陽性率為75％，CD4陽性率為48％，CD8陽性率為31％(3)MMS形態(tài)為成纖維細胞樣，貼壁生長，48～72小時達生長高峰；波形蛋白、nestin、CD133表達陽性；角蛋白、CD34、DB表達陰性。傳12代細胞及凍存復(fù)蘇后細胞形態(tài)觀察及波形蛋白、角蛋白檢測較前無改變。

4、　　 結(jié)論：體外培養(yǎng)的樹突細胞具有典型樹突細胞的形態(tài)學表現(xiàn)，脾源性T培養(yǎng)細胞純度達到試驗要求，后腎間充質(zhì)細胞，純度、穩(wěn)定性較高并符合干細胞特征。
　　 目的：觀察胚胎后腎間充質(zhì)細胞和抗IL-10抗體對T細胞、樹突細胞增殖以及對IL-4、INF-γ、穿孔素以及顆粒酶B表達的影響，探討其可能機制
　　 方法：(1)體外培養(yǎng)大鼠骨髓源性樹突細胞、脾源性T細胞和胚胎后腎間充質(zhì)細胞；(2)建立混合培養(yǎng)體系，觀察胚胎后腎間充質(zhì)細胞

5、和抗IL-10抗體對脾源性T細胞、樹突細胞以及樹突細胞誘導(dǎo)的T細胞增殖的影響；(3)建立Transwell培養(yǎng)體系，胚胎后腎間充質(zhì)細胞和抗IL-10抗體對脾源性T細胞、樹突細胞以及樹突細胞誘導(dǎo)的T細胞增殖的影響；(4)建立混合培養(yǎng)體系，觀察胚胎后腎間充質(zhì)細胞和抗IL-10抗體對樹突細胞誘導(dǎo)的T細胞IL-4、INF-γ、穿孔素以及顆粒酶BmRNA和蛋白表達的影響；(5)建立Transwell培養(yǎng)體系，觀察胚胎后腎間充質(zhì)細胞和抗IL-10抗

6、體對樹突細胞誘導(dǎo)的T細胞IL-4、INF-γ、穿孔素以及顆粒酶BmRNA和蛋白表達的影響。
　　 結(jié)果：(1)混合培養(yǎng)體系中，與對照組相比，試驗組T淋巴細胞增殖活性、樹突細胞增殖活性、樹突細胞誘導(dǎo)的T細胞增殖活性均降低，在R：S比值1：80范圍內(nèi)成劑量依賴關(guān)系。細胞增殖抑制率在1：80、1：160兩組之間沒有顯著性差異。與R：S組相比，Anti-IL-10組T細胞增殖率明顯增加，與陽性對照組相比，增殖率明顯降低)；(2)Tran

7、swell培養(yǎng)體系中，與對照組相比，試驗組T淋巴細胞增殖活性、樹突細胞增殖活性、樹突細胞誘導(dǎo)的T細胞增殖活性均降低，與R：S比值成劑量依賴關(guān)系，隨R：S的減小，T細胞的增殖率逐漸下降。細胞增殖抑制率在1：80、1：160兩組之間沒有顯著性差異。與R：S(1：80)組相比，Anti-IL-10組T細胞增殖率明顯增加，與陽性對照組相比，增殖率明顯降低；(3)混合培養(yǎng)體系中，與對照組相比，試驗組樹突細胞誘導(dǎo)的T細胞IL-4、INF-γ、穿孔素

8、以及顆粒酶B mRNA和蛋白表達均明顯下降，在R：S比值1：80范圍內(nèi)成劑量依賴關(guān)系。細胞增殖抑制率在1：80、1：160兩組之間沒有顯著性差異。(4)Transwell培養(yǎng)體系中，與對照組相比，試驗組樹突細胞誘導(dǎo)的T細胞IL-4、INF-γ、穿孔素以及顆粒酶B mRNA和蛋白表達均明顯下降，在R：S比值1：20～1：80范圍內(nèi)成劑量依賴關(guān)系。細胞增殖抑制率在1：80、1：160兩組之間沒有顯著性差異。
　　 結(jié)論：胚胎后腎間充

9、質(zhì)細胞可能通過直接接觸和旁分泌作用抑制樹突細胞、T細胞以及樹突細胞誘導(dǎo)的T細胞的增殖，抑制樹突細胞誘導(dǎo)的T細胞IL-4、INF-γ、穿孔素以及顆粒酶B mRNA和蛋白的表達。
　　 目的：探討胚胎后腎間充質(zhì)細胞對慢性血清病腎炎大鼠免疫調(diào)節(jié)作用以及對腎臟損傷的治療作用。
　　 方法：(1)體外原代培養(yǎng)胚胎后腎間充質(zhì)細胞，GFP標記；(2)建立慢性血清病腎炎模型大鼠；(3)大鼠分為5組：空白對照組、陰性對照組、模型組、MMS

10、預(yù)處理組和MMS移植干預(yù)組；(4)熒光顯微鏡定位GFP標記的胚胎后腎間充質(zhì)細胞在大鼠體內(nèi)的分布：(5)常規(guī)病理染色觀察五組大鼠腎臟病理變化；(6)流式細胞術(shù)檢測五組大鼠外周血T細胞亞群；(7)ELISA法檢測五組大鼠血清IL-4、INF-γ水平；(8)RT-PCR法檢測五組大鼠外周血單個核細胞IL-4、INF-γ、穿孔素和顆粒酶B mRNA的表達。
　　 結(jié)果：(1)模型復(fù)制結(jié)束時，與空白對照組和陰性對照組相比，模型組、MMS預(yù)

11、處理組大鼠尿蛋白明顯升高，總蛋白水平、白蛋白水平明顯降低，總膽固醇水平明顯增加；MMS預(yù)處理組尿蛋白水平較模型組明顯降低。(2)實驗結(jié)束時，與模型組相比，MMS移植組尿蛋白水平均較模型組明顯下降，預(yù)處理組下降更明顯。與移植組相比，預(yù)處理組尿蛋白水平明顯降低。(3)GFP標記的MMS向肝臟、脾臟和腎臟歸巢，但不能向腦組織以及心臟歸巢。(4)與模型組比較，MMS移植組腎臟病理損傷減輕；與MMS移植組相比，MMS預(yù)處理組腎臟病理損傷減輕。(5

12、)與空白對照組和陰性對照組相比，模型組、MMS預(yù)處理組和MMS移植組大鼠外周血Th細胞比例下降、Ts細胞比例升高，Th/Ts比例下降，差別具有顯著性意義。與模型組比較，MMS預(yù)處理組和MMS移植組大鼠外周血Th細胞比例下降、Ts細胞比例升高，差別無統(tǒng)計學意義，Th/Ts比例下降，差別具有顯著性意義。與MMS預(yù)處理相比，MMS移植組大鼠Th/Ts比例下降，差別具有顯著性意義。(6)與空白對照組和陰性對照組相比，模型組大鼠外周血IL-4水平

13、明顯增高，INF-γ水平明顯降低，差別具有顯著性意義，MMS預(yù)處理組和MMS移植組大鼠外周血IL-4水平明顯增高，INF-γ水平明顯降低，差別具有顯著性意義。與模型組比較，MMS預(yù)處理組和MMS移植組大鼠外周血IL-4水平降低，INF-γ水平明顯升高，差別有統(tǒng)計學意義。與MMS預(yù)處理相比，MMS移植組大鼠大鼠外周血IL-4水平增高，INF-γ水平明顯降低，差別具有顯著性意義。(7)與空白對照組和陰性對照組相比，模型組大鼠外周血單個核細胞

14、IL-4、穿孔素、顆粒酶BmRNA表達增高，INF-γ mRNA表達明顯減低，差別具有非常顯著性意義，MMS預(yù)處理組和MMS移植組大鼠外周血IL-4、穿孔素、顆粒酶BmRNA表達增高，INF-γ mRNA表達明顯減低，差別具有顯著性意義。與模型組比較，MMS預(yù)處理組和MMS移植組大鼠外周血IL-4、穿孔素、顆粒酶B mRNA表達表達水平降低，INF-γmRNA表達明顯增高，差別有統(tǒng)計學意義。與MMS預(yù)處理相比，MMS移植組大鼠大鼠外周血

15、IL-4、穿孔素、顆粒酶B mRNA表達水平增高，INF-γ mRNA表達水平降低，差別具有顯著性意義。
　　 結(jié)論：胚胎后腎間充質(zhì)細胞可以調(diào)節(jié)慢性血清病腎炎大鼠免疫狀態(tài)，減輕腎臟損傷。
　　 目的：分離、培養(yǎng)大鼠脾臟T細胞、胚胎后腎間充質(zhì)細胞，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓源性樹突細胞，為后續(xù)體外模擬胚胎后腎間充質(zhì)細胞的免疫調(diào)節(jié)作用、細胞移植研究提供細胞來源及依據(jù)。
　　 方法：(1)健康SD雌性大鼠，10％水合氯醛麻醉后無

16、菌條件下取出股骨和脛骨，RPMI1640基本培養(yǎng)基沖洗骨髓腔獲骨髓腔沖洗液，密度梯度分離后將單個核細胞用含GM-CSF、TNF-α和IL4完全營養(yǎng)液混懸后與37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)，并進行免疫表型鑒定。(2)取SD大鼠，麻醉后無菌條件下取脾，研磨成脾細胞懸液，密度梯度離心取單核細胞層，以RPMI1640基本培養(yǎng)基制成2×106/ml淋巴細胞懸液，置37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)，并進行流式細胞檢測。(3

17、)孕14天大鼠胚胎，分離胚胎腎臟，去除輸尿管芽，消化后置37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取傳至第3代的MMS倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞，并行HE染色、電鏡觀察、生長曲線測定;ABC免疫酶染色法檢測波形蛋白、角蛋白、nestin、CD133、CD34。另取傳12代細胞及凍存復(fù)蘇后細胞(傳5代)培養(yǎng)，形態(tài)觀察，并波形蛋白、角蛋白檢測。
　　 結(jié)果(1)骨髓單個核細胞誘導(dǎo)后呈現(xiàn)典型樹突細胞形態(tài)，表現(xiàn)為毛刺狀突起、半貼壁生

18、長，并表達CD11C、CD86、MHC-Ⅱ等樹突細胞表面標志。(2)由脾臟分離的T淋巴細胞，經(jīng)流式細胞儀檢測，CD3陽性率為75％，CD4陽性率為48％，CD8陽性率為31％(3)MMS形態(tài)為成纖維細胞樣，貼壁生長，48～72小時達生長高峰：波形蛋白、nestin、CD133表達陽性；角蛋白、CD34、DB表達陰性。傳12代細胞及凍存復(fù)蘇后細胞形態(tài)觀察及波形蛋白、角蛋白檢測較前無改變。
　　 結(jié)論：體外培養(yǎng)的樹突細胞具有典型樹突