結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞分選及131I標(biāo)記AC133 mAb對荷瘤裸鼠模型的體內(nèi)示蹤研究.pdf

1、目的
　　1.采用免疫磁珠分選系統(tǒng)(MACS)從結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞中分選CD133(+)細(xì)胞,研究CD133(+)細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性。
　　2.標(biāo)記AC133mAb制備抗體探針,通過體外實(shí)驗(yàn)明確抗體探針的放化純、穩(wěn)定性、特異性及免疫活性。
　　3.采用抗體探針對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)示蹤,通過生物分布、分子生物學(xué)技術(shù)及放射自顯影(ARG)明確抗體探針的靶向性。
　　方法
　　1.腫瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

2、
　　制備LoVo細(xì)胞單細(xì)胞懸液,加入FcRBlockingReagent、CD133MicroBeads孵育,孵育細(xì)胞分別過MS柱及LD柱獲得CD133(+)細(xì)胞及CD133(-)細(xì)胞。分選細(xì)胞在含表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)和堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM)中培養(yǎng),觀察其成球性。采

3、用流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞免疫熒光鑒定分選細(xì)胞純度。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)過程中CD133表達(dá)率,對比加入胎牛血清前后形態(tài)學(xué)及CD133表達(dá)率的變化。采用CCK-8法檢測5-FU對分選細(xì)胞的毒性。對比CD133陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞在BALB/c裸鼠體內(nèi)的成瘤性差異。
　　2.AC133mAb的標(biāo)記、純化、放化純、穩(wěn)定性測定及細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)
　　采用腹水法制備AC133mAb并純化。通過Iodogen法用131I標(biāo)記抗體,按抗體重量(mg

4、)與131I放射性活度(mCi)比值1:30進(jìn)行標(biāo)記。采用離心超濾法純化標(biāo)記抗體,計(jì)算標(biāo)記率。通過ITLC測定標(biāo)記抗體的放化純,并檢測其體外穩(wěn)定性。設(shè)LoVo細(xì)胞、CD133(+)細(xì)胞、CD133(-)細(xì)胞及LoVo細(xì)胞未標(biāo)記抗體阻斷組,檢測標(biāo)記抗體孵育15min、30min、60min、120min及240min后各組細(xì)胞的結(jié)合率。
　　3.荷瘤裸鼠SPECT/CT顯像及生物分布
　　建立未分選、CD133(+)及CD13

5、3(-)LoVo細(xì)胞的BALB/c荷瘤裸鼠動物模型。尾靜脈注射14.8MBq~18.5MBq(400μCi~500μCi)131I-AC133mAb,分別于注射后1、3、5、7天用SPECT/CT采集圖像。顯像結(jié)束后取裸鼠腫瘤及部分器官組織,測量每克組織百分注射劑量率(％ID/g)。
　　4.腫瘤組織免疫熒光、Westernblot及放射自顯影
　　顯像后取移植瘤、肝臟、腎臟及肌肉組織,采用Westernblot檢測CD13

6、3表達(dá)量;制備組織冰凍切片,通過免疫熒光檢測各組織CD133的表達(dá);通過放射自顯影檢測標(biāo)記抗體在各組織的放射性分布。
　　結(jié)果
　　1.MACS分選結(jié)果鑒定
　　MACS分選后,FCM檢測分選陽性細(xì)胞CD133表達(dá)率為81.30%±1.83%,明顯高于分選陰性細(xì)胞(0.98%±0.79%)及未分選細(xì)胞組(48.23%±2.15%)(P<0.05)。免疫熒光顯示分選陽性細(xì)胞膜表面見強(qiáng)熒光,而在陰性細(xì)胞表面僅見微弱熒光。<

7、br>　　2.腫瘤干細(xì)胞特性鑒定
　　CD133(+)細(xì)胞在SFM培養(yǎng)下見明顯懸浮腫瘤球,加入10%胎牛血清培養(yǎng)后腫瘤球消失,呈貼壁生長。CD133(+)細(xì)胞在SFM中CD133表達(dá)率下降緩慢,加入胎牛血清后CD133表達(dá)率迅速下降。而CD133(-)細(xì)胞始終低表達(dá)CD133。CD133(+)細(xì)胞比CD133(-)細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性和成瘤性。
　　3.131I-AC133mAb性質(zhì)鑒定
　　抗體標(biāo)記率為68.98%±

8、11.95%,純化后放化純?yōu)?4.35±0.45%,體外7天內(nèi)穩(wěn)定。CD133(+)細(xì)胞與標(biāo)記抗體的結(jié)合率在孵育2h后達(dá)高峰,為70.01%±6.02%,明顯高于未分選LoVo細(xì)胞(30.52%±1.14%),CD133(-)細(xì)胞(2.39%±0.26%)及特異性阻斷組(2.73%±0.25%)(P<0.05)。
　　4.體內(nèi)顯像及生物分布
　　131I-AC133mAb在CD133(+)、LoVo移植瘤逐漸濃聚,7天時顯像

9、清晰。CD133(-)及阻斷組移植瘤始終顯影較淡。肝臟、脾臟、腎臟、心臟及肺臟顯像劑濃聚明顯。
　　生物分布顯示,IV注射131I-AC133mAb后7天,LoVo和CD133(+)移植瘤%ID/g分別為6.12±1.91和6.97±1.40,明顯高于CD133(-)移植瘤(1.35±0.48)及阻斷組移植瘤(1.61±0.44)(P<0.05)。肝臟、脾臟、腎臟、心臟及肺臟%ID/g較低,血液%ID/g較高。
　　5.離體

10、實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果
　　免疫熒光及Westernblot顯示CD133(+)細(xì)胞、LoVo細(xì)胞及阻斷組移植瘤高表達(dá)CD133,CD133陰性細(xì)胞移植瘤、肌肉中幾乎無表達(dá)。ARG顯示CD133(+)細(xì)胞、LoVo細(xì)胞移植瘤組織中有明顯的放射性濃聚;CD133(-)細(xì)胞移植瘤、阻斷組移植瘤、肝臟、腎臟及肌肉中有少量的顯像劑濃聚。
　　結(jié)論
　　CD133(+)LoVo細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性。131I-AC133mAb具有良好的放