淋巴細胞浸潤結直腸癌的臨床特征及荷瘤鼠CD8+記憶亞群研究.pdf

1、研究背景及研究目的:
　　免疫是指機體免疫系統(tǒng)識別自身與異己物質,并通過免疫應答排除抗原性異物,以維持機體生理平衡的功能。而淋巴細胞則是免疫系統(tǒng)的重要組成部分,他可以通過直接或間接的方式來參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,包括分泌細胞因子來改變機體的免疫狀態(tài)和腫瘤微環(huán)境、直接浸潤到腫瘤組織中促進或抑制腫瘤細胞的生長等。眾所周知,浸潤到腫瘤微環(huán)境的免疫細胞包括先天性和適應性免疫應答細胞,如樹突細胞,B淋巴細胞和包括CD4+T和CD8+T細胞亞群

2、的T淋巴細胞[1]。Galon J et al.等研究表明表明,腫瘤組織中CD3+T細胞的密度是唯一的與病人的總生存相關聯(lián)的指標[2]。然而, CD3+T細胞包括CD4+T細胞亞群和CD8+T細胞亞群,到底是哪個細胞亞群在這其中起主要作用還不是很清楚。除了對T細胞的探討,Julie S et a等研究表明,在高分化卵巢癌中,腫瘤浸潤性CD20+B細胞(CD20+TIL)與患者的生存期有著緊密的聯(lián)系[3],在其他腫瘤中也如此,如乳腺癌[4

3、]和宮頸鱗狀細胞癌[5]。然而,CD20+TIL在結直腸癌中的作用尚不清楚[6]。所以在本研究中,我們通過免疫組化檢測結直腸癌組織芯片中CD4+,CD8+和CD20+ TIL在其瘤組織和癌旁組織中的浸潤情況,然后分析這些淋巴細胞亞群的結直腸癌患者中潛在的臨床意義。
　　研究方法:
　　1、制作結直腸癌組織芯片。
　　2、免疫組化檢測組織芯片中CD4+,CD8+和CD20+TIL在其瘤組織和癌旁組織中的浸潤情況。

4、　　3、分析CD4+,CD8+和CD20+TIL與結腸癌臨床病理特征的關系。
　　結果:
　　1、從免疫組化可以看出,無論是在腫瘤組織還是在癌旁組織,CD4+,CD8+和CD20+TIL的浸潤都可以很明顯的分為高浸潤組和低浸潤組。但是,相對于T細胞亞群來說, CD20+B細胞浸潤的數(shù)量很少,特別是在腫瘤組織中。
　　2、統(tǒng)計分析表明,腫瘤組織中,浸潤淋巴細胞亞群的量與患者的年齡、瘤大小、N分類和腫瘤分期之間沒有任何關系

5、。然而在腫瘤組織中, T1和T2期的患者比T3和T4期的患者有更高密度的CD20+B細胞的浸潤。此外,在癌旁組織中,M0期的患者比M1期的患者有更高密度的CD8+T細胞的浸潤。
　　結論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中浸潤的CD8+ T細胞和B細胞與結直腸癌的分期有一定的相關性。然而,考慮到CD4+T細胞的高異質性,所以有必要進一步研究浸潤性CD4+T細胞亞群的作用。此外,研究CD20+腫瘤浸潤淋巴細胞潛在的抗腫瘤機制有著重要的

6、臨床意義。此研究將對結直腸癌病人制定更有效的免疫療法有很大的提示意義。
　　研究背景及研究目的:
　　我們的研究發(fā)現(xiàn),腫瘤組織中浸潤的CD20+ B和CD8+ T細胞與腫瘤病人的病理參數(shù)有著一定的關系[1]。然而,眾所周知,參與抗腫瘤的T細胞主要是CD8+T淋巴細胞,而一系列的研究證明,初始CD8+T淋巴細胞在接受抗原刺激后會首先生成特異性的效應CD8+T淋巴細胞發(fā)揮其功能,而后這形成的90％-95%的特異性效應CD8+T淋

7、巴細胞在抗原清除后都死亡[2],幾周之內,少量生存的特異性CD8+T淋巴細胞會進一步分化成高表達CD62L和CCR7的記憶細胞[3]。當這群記憶細胞再次遭受相同抗原刺激時,會表現(xiàn)為特異性的克隆增殖能力及強有力的清除抗原的能力[4]。也有研究表明,在抗原刺激后生成的特異性效應細胞中有前體記憶CD8+T細胞的存在,只是不表現(xiàn)為記憶細胞的功能。在抗原清除幾周之后,這群抗原特異性的前體記憶CD8+T細胞的基因表達譜發(fā)生改變,獲得了記憶細胞的功能

8、,即包括再次遭受抗原刺激時表現(xiàn)出的快速的增值能力、細胞殺傷能力及高分泌細胞因子的能力,同時這群抗原特異性的前體記憶CD8+T細胞的表面分子CCR7和CD62L的表達升高且細胞的生存能力都明顯增強[5]。這表明前體記憶CD8+T細胞是存在于早期免疫反應中,只是在抗原清除后的幾周之內才會形成有保護作用的記憶細胞,并且這些記憶細胞高表達細胞表面分子 CCR7和CD62L[1]。
　　CCR7和CD62L是淋巴細胞歸巢到脾臟、淋巴結等次級

9、淋巴器官的重要分子[2]。在早期的研究發(fā)現(xiàn),通過不同的歸巢分子,特別是CCR7和CD62L,可以區(qū)分至少兩種記憶CD8+T細胞亞群[3],但是這些記憶細胞的形成機制還不是很清楚,在決定哪些細胞變?yōu)橛洃浖毎男┘毎呌谒劳龅倪@個過程還有待闡明,推測其最大的阻礙可能是缺少特異性的標志來區(qū)分生存細胞和死亡細胞的發(fā)展過程[4]。記憶細胞是高表達IL-7受體α鏈(CD127)的,越來越多的學者研究發(fā)現(xiàn),無論是在動物模型中還是在病人體內[5],C

10、D127的表達對 CD8+T細胞的記憶性的形成和成熟有著至關重要的作用[6]。已有研究表明,在效應 CD8+T細胞反應的高峰時期,有一小部分效應 CD8+T細胞高表達細胞表面分子CD127(IL-7Rα),且CD127的表達率與生成的記憶細胞的量成明顯正相關。因此推測, CD127hiT細胞是前體記憶 T細胞[7]。并且將 CD127hi和CD127lo的T細胞對小鼠進行ACT治療發(fā)現(xiàn),CD127hiT細胞有更強的保護機體的能力和成為長

11、效記憶細胞T細胞的能力[8]。眾多研究表明,IL-7信號是記憶T細胞所必須的,這表明CD127的表達并不只是與記憶細胞的數(shù)量有關,他還是記憶細胞的功能的形成所必須[9]。因此我們猜想,是否存在高表達CD127的同時也高表達CCR7或CD62L的一群CD8+T細胞,如果存在,這群細胞將有什么樣的功能,本文將以黑色素瘤小鼠為模型,就此問題進行探討。
　　研究方法:
　　1、制備黑色素瘤小鼠模型,流式細胞儀檢測黑色素瘤小鼠和正常小

12、鼠的血液、脾臟和骨髓中表達CD8、CD62L、CCR7和CD127的各細胞亞群的比例,找出目的細胞亞群,即CD8+CD62L+CD127+T細胞亞群。
　　2、免疫組化(IHC)、免疫熒光(IF)及磁珠分選和流式細胞術檢測黑色素瘤組織中目的細胞群的浸潤情況。
　　3、流式細胞儀分選目的細胞群,用MTT法檢測目的細胞群的增值情況、流式細胞術檢測目的細胞群的凋亡情況及Q-PCR和ELISA檢測細胞因子IFN-γ的分泌。
　

13、　4、將分選的目的細胞群用CFSE標記后,回輸入黑色素瘤小鼠體內,檢測其目的細胞群在體內的分布情況。
　　5、觀察分選出的目的細胞群在體內的抗腫瘤效果。
　　實驗結果:
　　1、從黑色素瘤小鼠和正常小鼠的血液、脾臟和骨髓中分離出淋巴細胞,經(jīng)流式檢測顯示,與正常小鼠的脾臟淋巴細胞相比,黑色素瘤荷瘤小鼠的脾臟淋巴細胞中CD8+CCR7+T細胞、CD8+CD62L+T細胞、CD8+CD127+T細胞、CD8+CD62L+CD

14、127+T細胞、CD8+CD62L+CC7+T細胞、CD8+CCR7+CD127+T細胞和 CD8+CCR7+CD62L+CD127+T細胞的比例都發(fā)生了不同程度的改變。經(jīng)統(tǒng)計結果分析發(fā)現(xiàn),在這些CD8+T細胞亞群中,黑色素瘤荷瘤小鼠脾臟中的CD8+CD127+T細胞、CD8+CD62L+T細胞和CD8+CD62L+CD127+T細胞的頻率顯著高于正常對照小鼠(P<0.05),但外周血和骨髓中的所有這些細胞的頻率在黑色素瘤荷瘤小鼠與正常

15、小鼠之間沒有顯著性差異。因很少有學者對CD8+CD62L+CD127+T細胞進行研究,所以本研究以此細胞群作為目的細胞群進行研究。
　　2、從組織化學(IHC)的結果可以得出,在黑色素瘤組織中,有明顯的 CD8+TIL的浸潤,且在癌旁成簇狀分布,在腫瘤組織中成散在分布。同時,腫瘤組織的管腔中也有 CD8+TIL的浸潤。免疫熒光雙染可以觀察到,腫瘤組織中有散在的CD8+CD127+TIL的分布。經(jīng)磁珠分選 CD8+TIL后用流式細胞

16、術檢測腫瘤浸潤淋巴細胞亞群,發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中有 CD8+CD62L+CD127+TIL細胞的存在,且比例占9%-10%左右。
　　3、MTT檢測顯示,將CD8+CD62L+CD127+T細胞與CD8+CD62L+CD127-T細胞和CD8+T細胞相比,CD8+CD62L+CD127+T細胞的增值能力明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而流式細胞術檢測顯示,CD8+CD62L+CD127+T細胞的凋亡能力比CD8+CD62L

17、+CD127-T細胞、CD8+T細胞的凋亡能力要弱,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。用 Q-PCR檢測 IFN-γ的 mRNA發(fā)現(xiàn),與 CD8+T細胞相比, CD8+CD62L+CD127+T細胞內 IFN-γ的 mRNA水平是顯著下降的(P<0.01),同時將CD8+CD62L+CD127-T細胞內IFN-γ的mRNA水平與CD8+ T細胞內IFN-γ的mRNA的水平進行比較,CD8+CD62L+CD127-T細胞內IFN-γ的m

18、RNA水平也是顯著降低的(P<0.05)。Elisa檢測其蛋白分泌情況,結果與mRNA的檢測結果是一致的。
　　4、將CD8+CD62L+CD127+T細胞群用CFSE標記后回輸入黑色素瘤小鼠體內后發(fā)現(xiàn),回輸?shù)募毎蠖嗑奂谄⑴K和淋巴結中,腫瘤組織中也有散在分布的回輸淋巴細胞的存在,而肝臟、腎臟則幾乎沒有觀察到回輸細胞的分布。
　　5、將分選出的CD8+CD62L+CD127+T細胞和CD8+T細胞在體外刺激培養(yǎng)后回輸入黑色

19、素瘤小鼠體內,發(fā)現(xiàn) CD8+CD62L+CD127+T細胞的抑制腫瘤生長的能力比CD8+T細胞的抑制腫瘤生長的能力強。
　　結論:
　　1、黑色素瘤荷瘤小鼠脾臟中CD8+CD127+、CD8+CD62L+和CD8+CD62L+CD127+T細胞亞群的頻率顯著高于正常對照小鼠。提示這三個細胞亞群有可能參與了小鼠黑色素瘤的發(fā)生與發(fā)展。
　　2、黑色素瘤組織中能檢測到 CD8+T淋巴細胞的浸潤,且 CD8+CD62L+CD1

20、27+T細胞亞群的比例可達到9%-10%左右,提示這增高的細胞亞群有可能直接參與了黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　3、與CD8+CD62L+CD127-T細胞和CD8+T細胞相比,CD8+CD62L+CD127+T細胞的增值能力增強,但凋亡能力減弱,這可能是脾臟中CD8+CD62L+CD127+T細胞亞群比例升高的直接原因;與此同時,CD8+CD62L+CD127+T細胞分泌 IFN-γ的能力是降低的,這與記憶細胞有著相似的特性。