大竹蟶肽聚糖識(shí)別蛋白的免疫防御功能研究.pdf

1、大竹蟶（Solen grandis）屬瓣鰓綱，廣泛分布于中國(guó)沿海各地。因其個(gè)體大、出肉率高、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，大竹蟶已成為我國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)品種之一。與其它海洋無(wú)脊椎動(dòng)物相似，大竹蟶缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠先天性免疫系統(tǒng)抵御外界病原微生物的侵害。
　　肽聚糖識(shí)別蛋白是無(wú)脊椎動(dòng)物先天性免疫中重要的模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別細(xì)菌的肽聚糖，在病原識(shí)別和清除過(guò)程中發(fā)揮重要作用。到目前為止，對(duì)大竹蟶肽聚糖識(shí)別蛋白的研究非常有限

2、，其抵御外來(lái)病原入侵的作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)合分子生物學(xué)和免疫生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，對(duì)大竹蟶肽聚糖識(shí)別蛋白介導(dǎo)的免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答進(jìn)行研究，旨在深入了解大竹蟶的先天性免疫機(jī)制。
　　(一)序列分析
　　本研究獲得了大竹蟶肽聚糖識(shí)別蛋白 SgPGRP-S1和SgPGRP-S2編碼基因的cDNA，其全長(zhǎng)分別為1672和1285 bp，各自編碼270和141個(gè)氨基酸。ExPASy預(yù)測(cè)兩個(gè)蛋白基因的理論等電點(diǎn)分別為7.82和5

3、.46，分子量分別為28.4和14.7 kDa。
　　同源性分析顯示SgPGRP-S1與SgPGRP-S2之間的相似度為51％，二者分別與光滑雙臍螺（ABO40829）和囊舌蟲（XP_002734591）的肽聚糖識(shí)別蛋白同源性最高，相似度分別為57%和55%。
　　多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SgPGRP-S1和SgPGRP-S2序列中均存在高度保守的Zn2+結(jié)合位點(diǎn)和酰胺酶催化位點(diǎn)，Zn2+結(jié)合位點(diǎn)分別為H135、H244和C252以

4、及H115和C123，酰胺酶催化位點(diǎn)分別為H135，Y170，H244，T250和C252以及H115、T121和C123。
　　構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹探討SgPGRP-S1和SgPGRP-S2與其它生物（牡蠣、櫛孔扇貝、海灣扇貝、果蠅和人）的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SgPGRP-S1和SgPGRP-S2與軟體動(dòng)物具有較高的同源性，與牡蠣的四種肽聚糖識(shí)別蛋白-S1S、-S1L、-S2，-S3聚合成支。
　　以上結(jié)果證明SgPGRP-S1和Sg

5、PGRP-S2是肽聚糖識(shí)別蛋白超家族的重要成員。
　　(二)熒光定量PCR檢測(cè)SgPGRP的轉(zhuǎn)錄規(guī)律
　　利用熒光定量PCR法檢測(cè)了SgPGRP-S1和SgPGRP-S2在健康大竹蟶組織中的轉(zhuǎn)錄規(guī)律，發(fā)現(xiàn)二者在所有檢測(cè)組織中都有表達(dá)。SgPGRP-S1在肌肉和肝胰腺中的表達(dá)量最高，其次為鰓、外套膜、性腺，在血細(xì)胞中的表達(dá)量最低；SgPGRP-S2在鰓和外套膜中表達(dá)量較高，其次為血細(xì)胞和性腺，在肌肉中表達(dá)量最低。
　　此

6、外，通過(guò)熒光定量PCR分析檢測(cè)LPS、PGN和glucan刺激后SgPGRP-S1在血細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律。經(jīng)PGN刺激后，SgPGRP-S1的表達(dá)量在3 h顯著升高為對(duì)照的14.3倍；在6 h達(dá)到最高，為對(duì)照組的7471倍；在12 h和48 h分別降低為對(duì)照組的13.9和5.7倍。經(jīng)glucan刺激后，SgPGRP-S1的表達(dá)量在12、24和48 h分別顯著升高為對(duì)照組的22.4、11.9和89.7倍。而在LPS刺激后，SgPGRP-S1

7、的表達(dá)量較對(duì)照組沒(méi)有顯著升高。
　　與SgPGRP-S1相比，SgPGRP-S2的表達(dá)量在LPS刺激后升高顯著，在6 h升高為對(duì)照組的4.1倍，在24 h和48 h又顯著下調(diào)為0.1和0.3倍。經(jīng)PGN刺激后，SgPGRP-S2的表達(dá)趨勢(shì)與SgPGRP-S1相似，在6 h達(dá)到高，在12 h略降低后，24 h升高為對(duì)照的4.4倍。在glucan刺激組，SgPGRP-S2的表達(dá)量在12 h顯著升高為對(duì)照組的23.1倍，隨后恢復(fù)到原始水

8、平。
　　(三) rSgPGRP-S1活性分析
　　PAMPs結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，SgPGRP-S1重組蛋白（rSgPGRP-S1）可以體外結(jié)合 PGN，其結(jié)合能力隨其濃度增大而增強(qiáng)。rSgPGRP-S1對(duì)LPS和β-glucan均無(wú)結(jié)合能力。這些結(jié)果表明SgPGRP-S1主要介導(dǎo)大竹蟶對(duì)PGN的免疫識(shí)別作用。
　　rSgPGRP-S1具有廣譜凝菌活性，對(duì)大腸桿菌和鰻弧菌等革蘭氏陰性菌以及藤黃微球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有凝集活性。

9、該結(jié)果初步揭示了SgPGRP-S1作為模式識(shí)別受體，參與大竹蟶對(duì)抵御入侵病原微生物的免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　進(jìn)一步研究rSgPGRP-S1的酰胺酶活性，發(fā)現(xiàn)其具有依賴Zn2+的酰胺酶活性，通過(guò)水解N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的肽鍵而降解不溶性PGN。使用平板擴(kuò)散法檢測(cè)rSgPGRP-S1對(duì)革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)存在 Zn2+時(shí)，rSgPGRP-S1對(duì)兩種細(xì)菌均具有顯著的抑制活性，產(chǎn)生明

10、顯的抑菌圈。
　　同時(shí)檢測(cè)rSgPGRP-S1對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響，發(fā)現(xiàn) Zn2+存在時(shí)，rSgPGRP-S1在細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期能夠明顯抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，而在生長(zhǎng)穩(wěn)定期表現(xiàn)出顯著的殺菌活性。rSgPGRP-S1的這種抑菌殺菌活性可能與其酰胺酶活性有關(guān)。
　　綜上所述，本論文研究了大竹蟶肽聚糖識(shí)別蛋白作為模式識(shí)別受體，介導(dǎo)對(duì) PAMPs和病原微生物等的免疫識(shí)別作用和抵御病原微生物入侵等免疫應(yīng)