肽聚糖識別蛋白PGRP-SC在家蠅腸道免疫中的功能分析.pdf

1、家蠅Musca domestica的整個生活史都與復(fù)雜的微生物環(huán)境有著緊密聯(lián)系，其高效的先天免疫防御機制能夠保護家蠅不受病原菌的侵害。但同時，微生物又在家蠅幼蟲發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，不恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)激可能對無害的共生菌群造成破壞，或?qū)C體造成損傷。因此家蠅需要嚴格控制免疫系統(tǒng)的強度，在維持共生菌與應(yīng)對病原體感染之間取得平衡。作為一種模式識別受體，肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition proteins, P

2、GRPs)在免疫系統(tǒng)應(yīng)對細菌感染過程中起著重要的調(diào)控作用。本實驗室前期在家蠅中克隆得到一種肽聚糖識別蛋白 PGRP-SC，該蛋白在家蠅幼蟲腸道中表達量最高，我們猜測家蠅PGRP-SC可能在腸道免疫中起調(diào)控作用。為驗證這一假設(shè)，我們通過RNAi技術(shù)干擾家蠅幼蟲PGRP-SC基因表達，進而對該肽聚糖識別蛋白在家蠅幼蟲腸道免疫中的功能進行鑒定。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴使用注射法和投喂法兩種方式嘗試對家蠅幼蟲PGRP-SC基因進行RN

3、A干擾：首先通過體外合成雙鏈RNA(double-strand RNA, dsRNA)并注射到家蠅1齡幼蟲體內(nèi)，利用qPCR技術(shù)檢測PGRP-SC基因的表達情況。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，在注射48 h后干擾組幼蟲目的基因表達量出現(xiàn)極顯著下調(diào)，最大干擾效率為70.94％。接下來，我們對家蠅1齡幼蟲投喂表達dsRNA的大腸桿菌，并利用qPCR檢測PGRP-SC基因表達情況。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，在注射24 h后干擾組幼蟲目的基因表

4、達量出現(xiàn)顯著下調(diào)，在注射48 h后干擾組幼蟲目的基因表達量出現(xiàn)極顯著下調(diào)，最大干擾效率為53.95%。⑵通過投喂表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的大腸桿菌可以在熒光顯微鏡下監(jiān)測攝入的外源細菌在家蠅幼蟲腸道內(nèi)的時空動態(tài)。分別對陰性對照組和干擾組完成投喂后，放置30 min再次在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)干擾組幼蟲腸道內(nèi)熒光明顯減弱，說明攝入的大腸桿菌被幼蟲清除。⑶分別對空白對照組、陰性對照組以及

5、干擾組幼蟲腸道內(nèi)過氧化氫含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)各組數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異，推測在上述清除過程中不涉及過氧化氫合成的參與。⑷利用熒光定量PCR技術(shù)，分別對陰性對照組和干擾組幼蟲腸道內(nèi)attacin, diptericin, muscin和cecropin等抗菌肽基因的表達情況進行了檢測，并發(fā)現(xiàn)干擾 PGRP-SC表達之后，4種抗菌肽基因表達均有不同程度的顯著上調(diào)，表明PGRP-SC在控制家蠅幼蟲腸道免疫敏感程度中起作用。干擾PGRP-SC基因