家蠅lysozyme和defensin基因的鑒定及功能分析.pdf

1、家蠅（Musca domestica）雖生活在病原菌滋生的惡劣環(huán)境中，井傳播多種疾病，但自身卻很少被感染。這說明家蠅在長期的進(jìn)化過程中，形成了一套強(qiáng)大而高效的免疫防御機(jī)制來對(duì)付各種各樣的病原菌侵染，其中很重要的因素就是家蠅體內(nèi)的抗菌肽，家蠅防御素和溶菌酶就是其中的兩類。研究抗菌肽的作用和抗菌機(jī)制等，為家蠅抗菌肽進(jìn)行更深入研究具有很重要的理論價(jià)值實(shí)際意義，為找到新型的抗菌類藥物帶來新的曙光。
　　本文以家蠅幼蟲為研究對(duì)象，研究內(nèi)容主

2、要分為以下兩大部分：
　　第1部分：家蠅溶菌酶 lysozyme
　　1.通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索家蠅溶菌酶 lysozyme序列后，對(duì)搜索到的序列進(jìn)行編號(hào)命名，對(duì)其中一條溶菌酶運(yùn)用RACE技術(shù)從家蠅幼蟲體內(nèi)克隆得到的全長516 bp的cDNA序列，在NCBI進(jìn)行Blastp同源搜索，比對(duì)結(jié)果表明所得序列與家蠅 lysozyme2相似性最高，因此將其命名為家蠅 lysozyme3（GenBank登錄號(hào)為HQ897688）。

3、lysozyme3包含429 bp的完整的開放閱讀框（ORF）可編碼142個(gè)氨基酸殘基，包括20個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和122個(gè)氨基酸殘基組成的成熟肽，理論分子量為13.89 kD，理論等電點(diǎn)為6.45，含有8個(gè)半胱氨酸，可形成4對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。
　　2.通過 Northern blot檢測了lysozyme3在腸中的陽性信號(hào)最強(qiáng)，表達(dá)量最高，其次是在血細(xì)胞和整只蟲子當(dāng)中表達(dá)也較高，但是在表皮和脂肪體中井沒有明顯的陽性信號(hào)。

4、　　3.利用RNA i技術(shù)統(tǒng)計(jì)在家蠅幼蟲受到 lysozyme3 RNA干擾不同時(shí)間下干擾組和對(duì)照組家蠅幼蟲的體重差異顯示，在用lysozyme3-L4440菌（干擾組）喂養(yǎng)的家蠅幼蟲的體重明顯低于在用L4440菌（對(duì)照組）投喂的家蠅幼蟲的體重。
　　4.利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）分析表明，lysozyme3在腸中的表達(dá)量最高，其次是在血細(xì)胞和整只蟲子；在饑餓脅迫24 h. lysozyme3的表達(dá)量明顯下調(diào)；當(dāng)受

5、到細(xì)菌刺激后3-6 h表達(dá)迅速下調(diào)，在12-24 h出現(xiàn)一個(gè)短暫的恢復(fù)，而后又開始下調(diào)，直至60 h表達(dá)水平降到最低點(diǎn)。
　　5.利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了lysozyme3基因的重組表達(dá)，經(jīng)蛋白電泳在預(yù)測位置出現(xiàn)目的條帶。
　　第2部分：家蠅防御素 defensin
　　1.對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索家蠅防御素 defensin序列后，對(duì)搜索到的序列進(jìn)行編號(hào)命名，通過 RACE技術(shù)從家蠅幼蟲體內(nèi)克隆到其中1條家蠅防御素基

6、因 defensin2。defensin2全長392 bp的序列，包含276 bp的完整開放閱讀框，編碼91個(gè)氨基酸殘基組成的多肽 N端除有一段23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽外，還有一段28個(gè)氨基酸殘基的前域。成熟肽由40個(gè)氨基酸殘基組成，理論分子量為4.0 kD，理論等電點(diǎn)8.69，結(jié)構(gòu)上形成3對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。經(jīng) Blastp分析該序列與昆蟲防御素的相似性較高，與王來城（2003）報(bào)道的家蠅成蟲的防御素（defensin1）基因氨基酸序列一

7、致性為93％。
　　2. RT-qPCR分析表明defensin2在脂肪體和血淋巴中的表達(dá)量最高，當(dāng)受到金黃色葡萄球菌刺激后表達(dá)量上調(diào)，大腸桿菌刺激后表達(dá)量下調(diào)。熱激恢復(fù)時(shí)表達(dá)量迅速上調(diào)。
　　3.在家蠅幼蟲受到 defensin2 RNA干擾情況下，經(jīng)革蘭氏陽性菌刺激24 h時(shí)，敲低組比對(duì)照組家蠅幼蟲的成活率明顯降低，經(jīng)革蘭氏陰性菌刺激24 h時(shí)，敲低組和對(duì)照組家蠅幼蟲的成活率基本相同。
　　4.通過 DNA步移法克

8、隆得到了678bp的啟動(dòng)子區(qū)域，利用NNPP和SoftBerry預(yù)測了＋1位且分?jǐn)?shù)高達(dá)0.97，在適當(dāng)位置發(fā)現(xiàn)了“TATA”框，所克隆的啟動(dòng)子序列中含有典型的免疫防御相關(guān)位點(diǎn) NF-B，C／EBP（CAAT enhancer-binding protein）還有多個(gè)AP家族序列（AP-1，AP-2，AP-3）。將克隆的啟動(dòng)子通過無啟動(dòng)子的綠色熒光載體pEGFP-1轉(zhuǎn)染 SF9昆蟲細(xì)胞發(fā)現(xiàn)有熒光信號(hào)。
　　5.利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)