轉(zhuǎn)GmTMT2a基因玉米植株的分子鑒定和功能分析.pdf

1、維生素E是一種只能由光合生物包括植物，藻類和一些藍(lán)藻細(xì)菌自身合成的一種淡黃色油狀物質(zhì)。它是一種有效地抗氧化分子，可以淬滅單線態(tài)氧，清除各種自由基。隨著社會(huì)的發(fā)展，人類需求的不斷提高，對(duì)維生素E的要求也越來(lái)越高，天然維生素E得到更大的重視與需求。通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段來(lái)獲取高含量的維生素E，成為當(dāng)前的重要研究方向。由于人們已經(jīng)清楚地知道了維生素E的合成途徑，了解其中的關(guān)鍵性酶基因的作用。所以人們開(kāi)始利用分子手段來(lái)通過(guò)改變植物體內(nèi)的這些酶基因從而改

2、變植物的生育酚含量。
　　在生育酚的四種形式中，α-生育酚是抗脂質(zhì)過(guò)氧化最有效的組分也是人體及動(dòng)物最好吸收的成分。在生育酚的合成途徑中，在合成下游有一個(gè)基因與α-生育酚的合成有關(guān)，就是γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶(γ-TMT)，它是生育酚生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，而此基因之前已由本實(shí)驗(yàn)室成功轉(zhuǎn)入玉米中，并已申請(qǐng)國(guó)家專利。本研究就是對(duì)轉(zhuǎn)GmTMT2a基因玉米進(jìn)行分子鑒定和功能分析，所獲結(jié)果如下：
　　1、對(duì)回交2代自交4代(BC2F4)

3、和回交2代自交5代(BC2F5)的轉(zhuǎn)GmTMT2a基因玉米幼葉進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到陽(yáng)性率結(jié)果分別為53.3％和62.8%，BC2F5代較BC2F4代陽(yáng)性率有提高。
　　2、利用Southern Blotting法檢測(cè)了轉(zhuǎn)GmTMT2a基因株系的拷貝數(shù)，同時(shí)檢測(cè)了Bar基因的拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)GmTMT2a基因株系的拷貝數(shù)為4~6個(gè)，Bar基因的拷貝數(shù)為1~3個(gè)。
　　3、利用Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)GmTMT2a基因玉米植株

4、的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株中GmTMT2a基因相對(duì)表達(dá)量在12以上，而在野生型陰性對(duì)照中幾乎無(wú)表達(dá)。
　　4、利用HPLC法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因植株的生育酚含量。BC2F4代中野生型中的α-維生素E僅為γ-維生素E的22%，轉(zhuǎn)GmTMT2a基因玉米中α-維生素E為γ-維生素E的1.6倍；BC2F5代中野生型中的α-維生素E僅為γ-維生素E的2.6%，轉(zhuǎn)GmTMT2a基因玉米中α-維生素E為γ-維生素E的12倍.
　　5、

5、轉(zhuǎn)GmTMT2a基因功能分析中，在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)GmTMT2a基因玉米和野生型植株的H2O2含量無(wú)明顯差異，干旱處理后，轉(zhuǎn)GmTMT2a基因玉米和野生型植株H2O2含量均有所增加，但轉(zhuǎn)基因植株增加至了正常條件下的1.2倍；而野生型植株增加至約1.8倍。在抗氧化酶活性檢測(cè)中，只有CAT有明顯變化，處理后，轉(zhuǎn)基因植物CAT活性較野生型株系明顯提高，約為野生型的4倍。SOD和POD均無(wú)明顯變化。選取的P5CS、P5CR和TPS三種抗旱基因