褐飛虱化學(xué)感受蛋白的分子鑒定和功能分析.pdf

1、復(fù)雜敏銳的嗅覺系統(tǒng)在草食性昆蟲寄主定位行為中起著重要的作用，如果能夠探明昆蟲嗅覺感受的機(jī)制，則可以為基于昆蟲嗅覺機(jī)制發(fā)展害蟲行為調(diào)控手段奠定重要的理論基礎(chǔ)。目前虛的許多研究表明，多種蛋白在昆蟲嗅覺感受過程中起著重要的功能，其中的化學(xué)感受蛋白(CSPs)被證明可參與昆蟲的嗅覺感受過程，但也許多研究發(fā)現(xiàn)CSPs也可能參與昆蟲的發(fā)育等其他生理過程，CSPs確切的功能目前仍不清楚。褐飛虱Nilaparvata lugens(Stal)是為害水稻

2、上重要的害蟲，每年給水稻產(chǎn)量造成巨大的損失。本課題組在前期對(duì)褐飛虱觸角轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)CSPs，但對(duì)于這些CSPs在褐飛虱嗅覺中的功能不明確。因此，我們?cè)趯?duì)褐飛虱幾個(gè)CSPs基因克隆的基礎(chǔ)上，對(duì)其CSPs的時(shí)空表達(dá)譜、重組CSPss與水稻揮發(fā)物的結(jié)合特性及機(jī)制進(jìn)行了研究，并通過RNA干擾技術(shù)分析了CSPs在褐飛虱行為選擇中的功能，以期為基于嗅覺感受機(jī)制發(fā)展褐飛虱的防治技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.褐飛虱化學(xué)感受蛋

3、白NIugCSP3的功能分析
　　在本研究中，為了更好的理解化學(xué)感受蛋白在褐飛虱中的生理功能，我們?cè)隗w外克隆了NIugCSP3基因。熒光定量PCR結(jié)果顯示NIugCSP3在3天交配短翅雌蟲觸角和三天未交配雄蟲腹末和觸角中高表達(dá)。通過體外熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合、熒光猝滅，我們提供了篩選行為活性物質(zhì)的一種可行有效的方法。在25種配基中，體外結(jié)合和行為選擇實(shí)驗(yàn)表明十九烷和2-十三酮與NIugCSP3表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)合活性而且能很好地吸引褐飛虱。N

4、IugCSP3與水稻揮發(fā)物有很好的結(jié)合活性表明其可能參與水稻普通氣味物質(zhì)的接受過程中。結(jié)合機(jī)制分析表明NIugCSP3與配基相互作用的很多信息。參與與配基相互作用的關(guān)鍵性氨基酸殘基被揭示。鑒于熱力學(xué)方程和聯(lián)合相互作用，疏水作用是NIugCSP3與配基相互作用的主要作用力。熒光猝滅實(shí)驗(yàn)也表明，十九烷和2-十三酮能使NIugCSP3發(fā)生靜態(tài)猝滅，而且兩者的結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行的，相互作用力主要為疏水性作用。此研究提供了一種從熒光猝滅的角度進(jìn)行行為

5、活性物質(zhì)篩選的方法。
　　2.褐飛虱化學(xué)感受蛋白NIugCSP8的功能分析
　　在此研究中，我們從褐飛虱中成功克隆了NIugCSP8基因序列。蛋白序列分析表明NIugCSP8與其他昆蟲CSPs具有很高的保守性并且含有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基。基因表達(dá)分析表明NIugCSP8基因特異性表達(dá)于3天交配短翅雌蟲的翅中，表達(dá)量是3天未交配短翅雌蟲翅的175倍。此外，NlugCSP8也高表達(dá)于5天未交配短翅雄蟲腹末中，與年齡、性別、成蟲

6、翅型和交配狀態(tài)有關(guān)。熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合表明，具有較長(zhǎng)碳鏈的配基如橙花叔醇、己醛和反-2-己烯醛與NIugCSP8具有很強(qiáng)的結(jié)合能力。通過利用生物信息學(xué)的同源建模與分子對(duì)接等方法，我們預(yù)測(cè)了NIugCSP8與具有良好結(jié)合活性的氣味物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。此外行為選擇實(shí)驗(yàn)表明，與NIugCSP8具有較強(qiáng)結(jié)合活性的氣味物質(zhì)中有四種氣味物質(zhì)能引起褐飛虱顯著的行為活性。NIugCSP8的功能進(jìn)一步被RNAi驗(yàn)證。RNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾NIugCSP8

7、之后褐飛虱對(duì)具有吸引作用的物質(zhì)的吸引效果明顯降低。此研究表明NIugCSP8可能會(huì)成為褐飛虱環(huán)境友好經(jīng)濟(jì)的防治靶標(biāo)。
　　3.褐飛虱化學(xué)感受蛋白NIugCSP10的功能分析
　　在此研究中，我們成功將NIugCSP10在大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，并在體外進(jìn)行熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)、熒光猝滅以及RNAi研究其可能具有的生理功能。結(jié)果顯示與雌蟲相比，NIugCSP10顯著高表達(dá)于雄蟲，可能參與交配的生理過程。熒光競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明NIu

8、gCSP10與順-3-己烯酯、二十烷和(+)-β-派烯具有很強(qiáng)的結(jié)合特性。為了證實(shí)NIugCSP10與配基的結(jié)合機(jī)制，通過同源建模和分子對(duì)接，我們發(fā)現(xiàn)其與配基相互作用的主要作用力為疏水性作用和范德華力。在這三種pH7.4條件下具有很強(qiáng)結(jié)合能力的配基中，二十烷對(duì)褐飛虱具有很強(qiáng)的吸引作用，順-3-己烯乙酸酯和(+)-β-派烯表現(xiàn)出很強(qiáng)的驅(qū)避作用。本研究通過RNA干擾技術(shù)也證NIugCSP10參與褐飛虱識(shí)別順-3-己烯乙酸酯的過程。總之，我們