豬肺免疫防御相關基因—肺表面活性蛋白A的研究.pdf

1、豬呼吸系統(tǒng)疾病(PRD)已成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)的頭號疾病，肺免疫防御相關基因的研究和挖掘對于從遺傳本質上提高豬對呼吸系統(tǒng)疾病的抗性具有重要意義。 本文利用比較基因組學方法，以肺免疫防御相關基因—豬肺表面活性蛋白A(SP-A)作為豬呼吸系統(tǒng)免疫防御功能的候選基因，開展了豬肺表面活性蛋白A序列及其多態(tài)性、mRNA表達和蛋白質含量變化的系列研究，取得了以下結果： ①采用RT-PCR和RACE技術獲得了長度為1910bp的豬SP-

2、A完整cDNA序列，此序列包含了編碼248個氨基酸的長為747bp的完整開放閱讀框。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，豬SP-A的N端有20個殘基的信號肽，從N端到C端依次為4個結構域：短的N-端區(qū)、膠原樣區(qū)域、莖區(qū)和碳水化合物識別區(qū)域。然后又用比較基因組學方法和引物步移法獲得了長度為4229bp的豬SP-ADNA全序列，它由4個外顯子和3個內含子組成。 ②以同一時期飼養(yǎng)在相同條件下的引進品種大白豬361頭、培育品種松遼黑豬132頭為試驗群1

3、，采用PCR-SSCP技術檢測到33個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點，其中有5個SNPs位于外顯子上，3個為同義突變，2個為錯義突變；這2個錯義突變位于豬SP-A的碳水化合物識別區(qū)域，分別造成了丙氨酸變異為蘇氨酸、苯丙氨酸變異為酪氨酸。這些SNPs位點呈完全連鎖不平衡狀態(tài)，組成了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三種單體型。經x2檢驗表明，在大白豬試驗群中，SP-A的基因頻率和基因型頻率都達到了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)；但是在松遼黑

4、豬試驗群中，SP-A的基因頻率和基因型頻率都未達到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.01)。目前，兩個品種豬的SP-A基因都處于中度多態(tài)。 在品種內，不同性別SP-A單體型頻率分布差異不顯著(P>0.05)。在大白豬中，SP-AⅡ單體型豬的PRD發(fā)病率最高，達33.67％，并且不同SP-A基因單體型大白豬PRD發(fā)病率差異極顯著(P<0.01)；在松遼黑豬中，也是SP-AⅡ單體型豬的PRD發(fā)病率最高，為10.53％，不

5、同SP-A基因單體型松遼黑豬的PRD發(fā)病率差異顯著(P<0.05)；表明在大白豬和松遼黑豬中，單體型與PRD發(fā)病率之間存在一定的關聯(lián)度。其中SP-A基因I單體型為抗PRD單體型，推測以SP-AI單體型豬具有較強的肺免疫防御功能。 ③通過以0.05ml/kg體重，少量分次，耳靜脈注射油酸成功建立了豬油酸—急性肺損傷模型，為進一步開展有關豬肺損傷以及肺免疫防御相關研究奠定了基礎。 ④以包含SP-A基因Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ單體型共54頭

6、仔豬建立試驗群2，在仔豬斷奶穩(wěn)定后50±1日齡建立油酸—急性肺損傷模型。以肺含水量的變化作為反映肺損傷程度的指標，分別采用熒光定量PCR和westernblot技術對肺組織中SP-AmRNA表達量和支氣管—肺泡灌洗液(BALF)中SP-A蛋白含量進行檢測與分析，發(fā)現(xiàn)：在1h時相點伴隨肺含水量的增加，SP-AmRNA表達量和SP-A蛋白含量均下降；在3h時相點伴隨肺含水量增加至最高(3個時相點中相比較)，SP-AmRNA表達量和SP-A蛋

7、白含量也降至三個時相點的最低水平；與1h時相點相比較，在6h時相點伴隨肺含水量的下降，SP-AmRNA表達量和SP-A蛋白含量分別極顯著上升(P<0.01)和顯著上升(p<0.05)。另外，與Ⅱ和Ⅲ單體型相比較，各時相點SP-AI單體型豬的肺含水量較對照組的升高幅度要?。籅ALF中SP-A蛋白含量較高，更接近于對照組水平；1h和3h時相點SP-AI單體型豬肺組織中的SP-AmRNA表達量也較高，也更接近于對照組水平，并且在6h時相點SP

8、-AI單體型豬的SP-AmRNA表達量顯著高于Ⅱ和Ⅲ單體型。上述結果表明，肺組織中SP-AmRNA表達量、BALF中SP-A蛋白含量與肺含水量即肺損傷程度的變化趨勢恰好相反；在同時受到病原致?lián)p傷的情況下，SP-AI單體型豬的SP-A水平會在較短時間內恢復而有利于盡快緩解病原對肺的損傷，因此，推測SP-AI單體型豬具有較高的應對病原損傷肺的能力。 以上結果表明，豬SP-A同人、小鼠等的SP-A一樣，也具有肺免疫防御功能；不同SP-

9、A單體型與PRD發(fā)病率之間存在一定關聯(lián)性，其中又以SP-AI單體型的豬具有較強的肺免疫防御能力，能夠使外來因素對肺臟的損傷程度降至最低，損傷時間降至最短，因而也降低了豬只由于長時間處于致病原損傷狀態(tài)下而引起繼發(fā)感染的可能，具有較低的PRD發(fā)病率。 本研究結果首次較全面地揭示了豬SP-A的肺免疫防御功能，同時也為判斷發(fā)生PRD時豬只肺損傷的程度，為PRD的臨床診斷以及防治PRD新型藥物的研發(fā)和選擇肺免疫防御功能強的種豬個體奠定了一