99mTc-Syt-C2A分子探針探測非小細(xì)胞肺癌化療誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的： 1.2—亞氨基噻吩鹽酸鹽（2—IT）修飾突觸結(jié)合蛋白Synaptotagmin的C2A蛋白（Syt—C2A）用99mTc—GH（葡庚糖酸鈉）轉(zhuǎn)換絡(luò)合法標(biāo)記合成99mTc—SytC2A—GST，研究最佳標(biāo)記條件及其生物分布和理化性質(zhì)。 2.探討99mTc—Syt—C2A—GST及放射性核素顯像探測非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）化療后腫瘤組織細(xì)胞凋亡的可行性。 3.探討非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療后較理想的凋亡時(shí)間

2、窗，為凋亡顯像真正向臨床過渡奠定基礎(chǔ)。 4.建立一種無創(chuàng)傷性的凋亡體內(nèi)顯像方法，實(shí)時(shí)監(jiān)測放化療后腫瘤細(xì)胞凋亡，早期預(yù)測和評價(jià)非小細(xì)胞肺癌化療效果，建立以細(xì)胞凋亡為靶點(diǎn)早期評價(jià)腫瘤治療療效的新策略，有助于腫瘤治療個體化。 研究方法 1.SytI—C2A以SytI—C2A—GST（突觸結(jié)合蛋白I—C2A片段—谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白）的形式由基因工程制備，編碼SytI—C2A—GST的表達(dá)質(zhì)粒由美國威斯康星醫(yī)學(xué)院趙明教

3、授提供。 2.99mTc—Syt—C2A—GST的標(biāo)記合成大致可分成3步：1、2—IT修飾C2A—GST；2、99mTc—GH（葡庚糖酸鈉）轉(zhuǎn)換絡(luò)合；3、分離純化。 3.99mTc—Syt—C2A—GST質(zhì)量控制?？焖俦訉游龇y定標(biāo)記化合物放化純和膠體含量；分別測定1、2、4、和8h放化純，判斷標(biāo)記化合物體外穩(wěn)定性。 4.血液清除曲線測定：小鼠尾靜脈注入0.1mCi的99mTc—Syt—C2A—GST標(biāo)記顯像劑

4、，分別于注射后5、10、15、30、60、120和180min取靜脈血0.1ml測放射性計(jì)數(shù)，繪制血液放射性清除曲線，計(jì)算半清除時(shí)間（T1/2）。 5.小鼠99mTc—Syt—C2A—GST體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)及代謝途徑測定： 將體積約0.2ml，放射性活度0.2mCi的99mTc—Syt—C2A—GST從尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，按注射后5min、10min、20min、1h、2h、4h、6h和24h共分成8組，每組6只，分別處死，

5、取出心、肺、肝等重要臟器，稱重，測定各器官的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算上述各器官的%ID和%ID/g值。 6.NCI—H460非小細(xì)胞肺癌腫瘤裸鼠模型的制備： 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI—H460接種于含15%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%—90%融合時(shí)，胰酶消化，保證活細(xì)胞率大于99%。取4—5周齡的BALB/C雌性裸小鼠，將含1×106的腫瘤細(xì)胞懸液0.2ml，注射于鼠右頸近前腋皮下。 7.紫杉

6、醇誘導(dǎo)荷NSCLC裸鼠凋亡，劑量為一次注射100—200mg/㎡。 8.99mTc—Syt—C2A—GST顯像： 經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)荷肺癌裸鼠分成5組，分別為化療后12h、24h、48h、72h及未誘導(dǎo)對照組，每組各5只，注射99mTc—Syt—C2A—GST1mCi（37MBq），2、4和6h后行靜態(tài)顯像。 9.99mTc—C2A—GST—NHS及99mTc—IgG顯像：紫杉醇誘導(dǎo)后72h裸鼠分別注射無活性99mTc

7、—Syt—C2A—GST（99mTc—C2A—GST—NHS）和99mTc—IgG1mCi（37MBq），2h、4h、6h后顯像。勾畫腫瘤和正常對側(cè)組織感興趣區(qū)，計(jì)算腫瘤和對側(cè)肌肉組織的放射性比值。 10.腫瘤細(xì)胞凋亡的體外測定方法：顯像后處死荷瘤裸鼠，取出腫瘤組織。光鏡、電鏡觀察凋亡形態(tài)學(xué)改變（核固縮、核深染、凋亡小體等改變），流式細(xì)胞術(shù)定量測定細(xì)胞凋亡峰，免疫組化原位細(xì)胞凋亡檢測方法（TUNEL）測定凋亡細(xì)胞。 11

8、.流式細(xì)胞術(shù)定量測定活化半胱天冬蛋白水解酶Caspase—3。 結(jié)果： 1.n（2—IT）：n（C2A—GST）=20：1是最佳修飾比例，修飾后每分子99mTc—C2A—GST可產(chǎn)生7個巰基用于標(biāo)記，而修飾前僅有2.87個，且都在空間結(jié)構(gòu)的內(nèi)部。 2.純化后99mTc—Syt—C2A—GST的放化純大于90%，且可穩(wěn)定8h，符合顯像要求。 3.肝腎是放射性攝取最多的器官，表明99mTc—Syt—C2A—G

9、ST主要經(jīng)肝腎代謝清除，其次是兩肺、脾臟和骨骼。在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)未見任何副作用或不良反應(yīng)發(fā)生4.99mTc—Syt—C2A—GST血液半清除時(shí)間<15min。 5.化療組腫瘤組織有顯著放射性攝取，24、48h達(dá)到高峰，而對照組均無明顯放射性攝取，化療后24、48、72hT/NT及腫瘤組織攝?。?ID/g）同未化療組相比有顯著性差異。 6.99mTc—C2A—GST—NHS對照組顯像研究表明，無論是化療組或未化療組腫瘤部位均無

10、明顯99mTc—C2A—GST—NHS攝取。 7.化療后腫瘤組織細(xì)胞凋亡明顯增加，HE及TUNEL染色均觀察到大量核深染、核固縮和凋亡小體形成；腫瘤99mTc—Syt—C2A—GST攝取及TUNEL凋亡細(xì)胞有很好的相關(guān)性。 8.化療后腫瘤活化Caspase—3水平明顯增加與腫瘤99mTc—Syt—C2A—GST攝取及T/NT有很好相關(guān)性。 結(jié)論： 1.99mTc—Syt—C2A—GST經(jīng)2—IT修飾，GH

11、轉(zhuǎn)換標(biāo)記方法簡便易行，體內(nèi)外穩(wěn)定性好，適合于核醫(yī)學(xué)顯像。 2.非小細(xì)胞肺癌化療后較理想的凋亡顯像較理想的顯像時(shí)間窗為48—72h；注射藥物99mTc—Syt—C2A—GST2小時(shí)便可得到較優(yōu)良的圖像，6小時(shí)后圖像最清晰，腫瘤和肌肉的比值最高。99mTc—Syt—C2A—GST是較優(yōu)秀的凋亡顯像劑。 3.99mTc—Syt—C2A—GST顯像可早期探測非小細(xì)胞化療后凋亡，并和活化Caspase—3水平及TUNEL凋亡指數(shù)呈