血管內(nèi)皮細(xì)胞microRNA-21在高糖環(huán)境及冠心病病人中表達(dá)的差異及其功能研究.pdf

1、目的：本課題擬利用血管內(nèi)皮細(xì)胞體外模型以及臨床樣本，研究在高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)差異的miRNA-21，并利用多種細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)方法，研究這些miRNA-21的生物學(xué)功能，從而初步闡釋miRNA-21在高糖環(huán)境下調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生理活動的分子機(jī)制。
　　 方法：所有入院患者在行選擇性冠狀動脈造影時均使用Seldinger穿刺法穿刺股動脈，置入6F/7F鞘管，在鞘管末端三通處先抽血約2ml棄去不要，再抽取10ml血液樣本于抗

2、凝常規(guī)管中，采用免疫磁珠法(內(nèi)含Beads直標(biāo)的anti-CD34抗體)分離血液樣本中的游離內(nèi)皮細(xì)胞放-80℃凍存；用濃度為30mM的葡萄糖處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)24小時后放-80℃凍存，用RT-PCR方法檢測細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)量。用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將miRNA-21抑制劑2’OMe-miRNA-21轉(zhuǎn)染到DMEM培養(yǎng)基孵育的HUVECs中，高糖處理48小時，收集細(xì)胞進(jìn)行雙向電泳分析，

3、通過質(zhì)譜鑒定鑒定出差異蛋白，Western-blot法驗(yàn)證差異蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、CHD組與對照組比較，有吸煙史的比例及年齡、體重、同型半胱氨酸、microRNA-21明顯高于對照組，兩者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)
　　 2、四組間在年齡、吸煙史、同型半胱氨酸、miR-21的比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 3、體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-21在高糖處理

4、后顯著上調(diào)(P<0.05)。
　　 4、通過對HUVECs進(jìn)行雙向電泳共鑒定得到差異表達(dá)的蛋白31個。其中在anti-miR-21組中上調(diào)13個，下調(diào)18個，其中4個蛋白具有最為顯著的差異，
　　 5、質(zhì)譜鑒定為分別是膜聯(lián)蛋白A2(ANNEXIN A2)，S100A4.線粒體超氧化物歧化酶(SOD2)，硫氧還蛋白(Thioredoxin)。
　　 5、通過western-blot列差異蛋白進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，ANNEX