RNA干擾介導(dǎo)泛素連接酶MuRF1和叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a基因下調(diào)延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的體外研究.pdf

1、目的
　　探討RNAi技術(shù)體外抑制MuRF1或FOXO3a基因表達(dá)的效果，為RNAi介導(dǎo)的失神經(jīng)骨骼肌萎縮基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法
　　訂購MuRF-1和FOXO3a兩基因的siRNA重組質(zhì)粒，培養(yǎng)大鼠成肌細(xì)胞系L6，將MuRF1和（或）FOXO3asiRNA重組質(zhì)粒在Lipofectamine2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，于轉(zhuǎn)染后48h與72h，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot檢

2、測(cè)siRNA重組質(zhì)粒對(duì)MuRF1和FOXO3a的mRNA和蛋白質(zhì)水平的抑制效果。
　　結(jié)果
　　1.轉(zhuǎn)染后24h，熒光倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞中有綠色熒光表達(dá)，表明成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大鼠成肌細(xì)胞系L6中。
　　2.實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果顯示：MuRF1與FOXO3a各自的siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h，二者干擾序列在mRNA水平分別明顯抑制了MuRF1和FOXO3a的表達(dá)，抑制率達(dá)67％和54％，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

3、義（P<0.05）,聯(lián)合MuRF1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h，干擾序列在mRNA水平亦明顯抑制了MuRF1及FOXO3a的表達(dá)，抑制率達(dá)61％及58％，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；轉(zhuǎn)染后72h，MuRF1與FOXO3a各自的siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對(duì)MuRF1和FOXO3a的mRNA的抑制率分別達(dá)79％和81％，聯(lián)合MuRF1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對(duì)MuRF1和FOXO

4、3a的mRNA的抑制率達(dá)77％及72％，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），抑制效應(yīng)與48h相比更為明顯。但單獨(dú)轉(zhuǎn)染組與聯(lián)合轉(zhuǎn)染組之間抑制效應(yīng)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.Western印跡灰度分析結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后48h，干擾序列MuRF1明顯抑制了MuRF1蛋白的表達(dá)，抑制率達(dá)61％，干擾序列FOXO3a明顯抑制了FOXO3a蛋白的表達(dá)，抑制率達(dá)46％，二者與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,

5、聯(lián)合MuRF1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對(duì)MuRF1和FOXO3a蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)64％及42％，與對(duì)照組相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；轉(zhuǎn)染后72h，干擾序列MuRF1對(duì)MuRF1蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)70％，干擾序列FOXO3a對(duì)FOXO3a蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)72％，同樣二者與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,聯(lián)合MuRF1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒干擾序列對(duì)MuRF1和FOXO3a

6、蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)73％及74％，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,抑制效應(yīng)較轉(zhuǎn)染后48h更為明顯。但單獨(dú)轉(zhuǎn)染組與聯(lián)合轉(zhuǎn)染組之間抑制效應(yīng)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這與干擾序列對(duì)mRNA表達(dá)水平的影響一致。
　　結(jié)論
　　1.RNA干擾技術(shù)在體外能夠明顯抑制泛素連接酶MuRF1和叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a基因的表達(dá)。
　　2.體外研究中MuRF1與FOXO3a兩基因siRNA重組質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染與各基因