激活瞬時受體電位香草醛亞家族1抗動脈粥樣硬化機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　 動脈粥樣硬化引起的心腦血管病是全球引起死亡的首要原因。目前認為AS是一種與脂質代謝紊亂相關的全身血管的慢性炎癥性疾病,基本的病理生理過程主要是內皮細胞的受損以及血液單核-巨噬細胞、血管平滑肌細胞在血管壁的沉積形成泡沫細胞,尤其在形成的晚期,主要是VSMC起作用。在內源性配體氧化低密度脂蛋白的刺激下,VSMC內膽固醇不斷增加轉化為泡沫細胞,泡沫細胞凋亡釋放出炎性物質進一步加重動脈粥樣硬化炎性病灶的發(fā)生和發(fā)展。細

2、胞泡沫化的核心是細胞內膽固醇動態(tài)平衡發(fā)生紊亂,涉及細胞對膽固醇的攝取和轉出異常,目前研究證實在人、大鼠、兔的平滑肌細胞上均存在膽固醇的攝取和轉出的一系列受體蛋白,包括低密度脂蛋白受體,低密度脂蛋白受體相關蛋白1,ATP結合盒轉運體1,提示平滑肌細胞可能參與了動脈粥樣硬化的脂質沉積,但是具體機制目前尚未明確。
　　 既往研究發(fā)現(xiàn),辣椒中的主要辣味成分辣椒素在減少炎癥反應、減少體脂聚集、調節(jié)血脂及能量代謝等方面也有積極的作用,這種辣

3、椒素的效應與兒茶酚胺水平升高有關,而是否與辣椒素的受體--瞬時受體電位香草醛亞家族1有關尚不明確。
　　 神經細胞TRPV1通道可被高溫、酸性環(huán)境、脂質、辣椒素等物質激活,導致以Ca2+為主的跨膜離子流動,進而激活一系列細胞內信號,參與多種傷害性刺激的分辨、整合以及炎癥反應。除神經系統(tǒng)外,TRPV1在血管、脂肪、肌肉、肝臟和胰腺均有分布,但對其在心血管和代謝中的作用研究甚少。我們研究發(fā)現(xiàn),辣椒素可激活脂肪細胞。TRPV1導致細胞

4、內鈣增加,減少脂質在細胞內的堆積,長期辣椒素干預可預防高脂飲食誘導的肥胖。據(jù)文獻報道,TRPV1在大鼠平滑肌細胞也有表達,其生理意義還不清楚。炎癥反應和細胞內膽固醇動態(tài)平衡都是動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的重要環(huán)節(jié),并且受細胞鈣信號的調控,因此,我們推測,激活平滑肌細胞TRPV1可能通過介導細胞內Ca2+變化影響血管炎癥反應和細胞內膽固醇動態(tài)平衡,從而預防動脈粥樣硬化。
　　 為了驗證上述推測,本研究分為三部分進行。第一部分采用蛋白免

5、疫印跡、RT-PCR、免疫熒光染色及比率熒光成像系統(tǒng)等技術,探討TRPV1在小鼠主動脈組織和平滑肌細胞表達、分布及其相應功能。第二部分分題一選用原代培養(yǎng)的平滑肌細胞作為研究對象,從離體水平探討激活TRPV1對平滑肌源性泡沫細胞內脂質蓄積的影響。分題二采用ApoE基因敲除型(ApoE-/-)小鼠作為研究對象,從藥物活性水平探討激活TRPV1后血清中炎癥因子(TNF-α,IL-6,hs-CRP)、血脂水平的變化及其對主動脈粥樣硬化斑塊的影響

6、;分題三選用遺傳學技術建立TRPV1ApoE雙基因敲除(TRPV1-/-ApoE-/-)小鼠作為研究對象,從基因水平探討TRPV1基因敲除對主動脈粥樣硬化斑塊的影響。分題四選用Wistar大鼠作為研究對象,以高脂飲食作為干預手段,研究血管旁脂肪對AS血管重構和功能及TRPV1、AMPK//mTOR信號分子的作用。第三部分采用蛋白免疫印跡、免疫熒光染色等分子生物學技術,探討激活TRPV1主動脈及平滑肌細胞上相關炎癥因子(MCP1、TNF-

7、α、CRP)、粘附分子(P-selectin、VCAM-1、ICAM-1)及脂質代謝相關受體(ABCA1、LRP1、CD36、SR-A)蛋白表達水平及其機制。
　　 材料與方法:
　　 整個研究采用離體實驗和在體實驗。離體實驗主要以原代培養(yǎng)的C57BL/6J野生型和TRPV-/-小鼠的主動脈平滑肌細胞作為研究對象。在體實驗以ApoE-/-和TRPV1-/-ApoE-/-小鼠、Wistar大鼠作為研究對象,ApoE-/-和

8、TRPV1-/-ApoE-/-小鼠隨機分為普食組(ND組),高脂組(HD組),普食加辣椒素組(Ncaps組)和高脂加辣椒素組(Hcaps組)。Wistar大鼠隨機分為普食組(Control組),高脂組(HFD組)。
　　 1.采用蛋白免疫印跡、RT-PCR、免疫熒光染色等分子生物學技術,探討TRPV1在小鼠主動脈組織和平滑肌細胞表達和分布。
　　 2.選用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠平滑肌細胞作為研究對象

9、。以TRPV1激動劑及其特異性拮抗劑作為藥物干預手段,利用比率熒光成像系統(tǒng)檢測細胞內[Ca2+]I變化。
　　 3.利用遺傳學及分子生物學技術,構建TRPV1-/-APOE-/-雙基因敲除小鼠。
　　 4.利用生化分析儀等儀器,采用生化檢驗技術及放免法檢測血清甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、炎癥因子(TNF-α,IL-6,hs-CRP)血糖、胰島素等生化指標,均嚴格按照試劑盒說明書進行。

10、>　　 5.以ApoE4-/-和TRPV1-/-ApoE-/-小鼠主動脈為研究對象,采用油紅O染色技術檢測主動脈斑塊內脂質沉積的情況,采用天狼猩紅染色技術檢測主動脈斑塊內膠原纖維的表達:采用免疫組化染色技術檢測主動脈斑塊內巨噬細胞、平滑肌細胞、淋巴細胞及脂質代謝相關受體(ABCA1和LRP1)的表達水平。
　　 6.采用Wistar大鼠作為研究對象,采用維多利亞蘭染色檢測主動脈中膜厚度,采用HE染色觀察血管旁脂肪的形態(tài);采用小

11、血管功能儀檢測血管活性;采用蛋白免疫印跡法檢測主動脈eNOS、TRPV1及AMPK/mTOR增殖信號分子表達。
　　 7.選用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠主動脈及平滑肌細胞作為研究對象,以TRPV1激動劑辣椒素、鈣離子載體A23187等藥物作為干預手段,采用蛋白免疫印跡法檢測主動脈及平滑肌細胞上脂質代謝相關受體(ABCA1和LRP1)、炎癥因子(MCP1、TNF-α、CRP)及粘附分子(P-selectin、VC

12、AM-1、ICAM-1)的表達。
　　 結果:
　　 1.TRPV1在主動脈和血管平滑肌細胞上均有表達,TRPV1激動劑可上調TRPV1表達。
　　 2.TRPV1激動劑可呈濃度依賴性地引起的VSMC內游離鈣離子的增加,而這種細胞內鈣信號變化可被TRPVl拮抗劑或TRPV1-/-所抑制。
　　 3.激活TRPV1可減少平滑肌細胞內脂質蓄積,TRPV1的特異性拮抗劑及TRPV1-/-則不能減少平滑肌細胞內脂

13、質蓄積。
　　 4.激活TRPV1可顯著降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的血清總膽固醇、甘油三酯水平,而對高脂喂養(yǎng)TRPV1-/-ApoE-/-小鼠血脂水平沒有影響。
　　 5.激活TRPV1后可顯著降低高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠血清hs-CRP、TNF-α和IL-6的水平,對高脂喂養(yǎng)TRPV1-/-ApoE-/-小鼠血清炎癥因子水平沒有影響。
　　 6.高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠的主動脈根部及腹主動脈的脂質斑塊

14、面積較高脂加辣椒素喂養(yǎng)組明顯增加,而TRPV1-/-ApoE-/-小鼠兩組間沒有顯著差異。比較ApoE-/-和TRPV1-/-ApoE-/-各組小鼠斑塊內巨噬細胞、平滑肌細胞及膠原纖維成份,結果顯示激活TRPV1對斑塊內上述成份的表達沒有影響。高脂加辣椒素喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠與高脂喂養(yǎng)小鼠比較斑塊內CD3表達減弱,脂代謝相關受體ABCA1表達增加,而LRP1表達減弱。
　　 7.成功構建了TRPV1-/-ApoE-/-小鼠。與

15、同窩ApoE-/-小鼠相比,TRPV1-/-ApoE-/-小鼠血清中炎癥因子(hs-CRP,TNF-α,IL-6)水平升高:血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平升高;TRPV1-/-ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積增加,斑塊內CD3表達增強,脂代謝相關受體ABCA1表達減弱,而LRP1表達增強。
　　 8.激活TRPV1可顯著上調主動脈和平滑肌細胞ABCA1的表達,而下調LRP1的表達。TRPV1基因敲除蛋白表達水平

16、變化不明顯。
　　 9.血管旁脂肪能夠明顯減少主動脈和腸系膜小動脈內皮依賴性血舒張反應,且高脂誘導后主動脈eNOS的表達下調,主動脈TRPV1功能受損,并伴隨著AMPK/mTOR增殖信號通路的改變。
　　 10.激活TRPV1使小鼠主動脈及平滑肌細胞炎癥因子(MCP1、TNF-α、CRP)、粘附分子(P-selectin、VCAM-1、ICAM-1)、脂代謝相關受體LRP1表達減弱,而脂代謝相關受體ABCA1表達則顯著增

17、強,TRPV1基因敲除則可抑制這種改變。
　　 11.鈣離子載體.A23187可顯著上調平滑肌細胞ABCA1的表達,下調LRP1的表達。TRPV1基因敲除蛋白表達水平變化不明顯。
　　 結論:
　　 1.TRPV1在小鼠主動脈和VSMC中均有表達。TRPV1激動劑可呈濃度依賴性地引起的VSMC內游離鈣離子的增加。TRPV1激動劑還可上調TRPV1的表達。這說明主動脈和VSMC中存在TRPV1通道的功能性表達。

18、r>　　 2.激活TRPV1可降低小鼠血清中的炎癥因子、總膽固醇和甘油三酯水平。激活TRPV1還可減少VSMC內脂質聚集及減少高脂飲食誘導的小鼠主動脈中AS斑塊的形成。而TRPV1基因敲出后上述各項指標均有不同程度的加重,提示TRPV1參與AS形成的調節(jié)。另外高脂誘導大鼠主動脈TRPV1功能受損,并伴隨著血管重構及功能障礙。
　　 3.激活TRPV1可上調ABCA1的表達,而下調LRP1的表達,同時可顯著下調多種炎癥因子,提示