HSPA12A mRNA、Eml5和HSPBAP1在耐藥性癲癇患者腦組織中的表達(dá).pdf

1、目的：研究耐藥性癲癇患者腦組織中差異基因及其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，并探討其在耐藥性癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用。 材料和方法：從我科建立的耐藥性癲癇患者術(shù)后腦組織庫(kù)中隨機(jī)抽取顳葉26例，海馬10例作為本次研究的實(shí)驗(yàn)組。其中男性19例，女性17例；年齡8-47歲，平均年齡21．88+9．62((x)±S)歲；病程2．5~30年，平均10．24+6．83((x)iS)年。部分繼發(fā)全身強(qiáng)直．陣攣性發(fā)作l7例，復(fù)雜部分性發(fā)作9例，多種發(fā)作形式10例(

2、強(qiáng)直性發(fā)作，單純部分性發(fā)作)。對(duì)照組8例，全部系來(lái)自顱腦外傷清創(chuàng)患者或意外死亡尸檢者的相對(duì)正常腦組織，納入的受試者無(wú)癲癇病史及其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病史，且病理切片證實(shí)腦組織結(jié)構(gòu)正常。其中顳葉5例，海馬3例；男4例，女4例，年齡17-66歲，平均31．59±11．65((x)±S)歲。 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腦組織取出后部分立即放入液氮(一196℃)中冷凍保存，用于基因芯片掃描、熒光定量PCR(nuorescencequantitati

3、vepolymerasechainreaction，F(xiàn)Q-PCR)和Westernblot分析；部分置于4％多聚甲醛固定48h，隨后常規(guī)石蠟包埋切片，常溫保存用于免疫組化染色。先用含有4096個(gè)人類(lèi)靶基因的基因芯片對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行檢測(cè)，篩選出候選基因棘皮動(dòng)物微管結(jié)合蛋白類(lèi)似蛋白5mRNA(echinodermmicrotubuleassociatedproteinlike5mRNA，Eml5mRNA．GenBank：NM183387

4、)，熱休克蛋白27相關(guān)蛋白1mRNA(heatshook27kDaassociatedprotein1mRNA，HSPBAPlmRNA．(_ienl3ank：AK096705)和熱休克蛋白70相關(guān)蛋白12AmRNA(heatshock70kDaprotein12AmRNA，HSPAl2AmRNA．GenBank：XM_048898)后，用FQ-PCR，免疫組化和Westernblot對(duì)芯片掃描結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果： 1總

5、RNA抽提及質(zhì)檢結(jié)果：兩組總RNA分別為279pg、275llg，總RNA的A260／A280比值分別為1．821、1．904，都位于1．8-2．2之間；電泳圖譜有清晰的條帶,70~C水浴保溫1h后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜未見(jiàn)明顯改變，提示兩樣品總RNA質(zhì)檢合格。 2基因芯片：對(duì)含有4096個(gè)人類(lèi)靶基因的基因芯片進(jìn)行掃描，共檢測(cè)出142條相關(guān)基因存在差異表達(dá)，其中104條表達(dá)上調(diào)，38條表達(dá)下調(diào)。其中候選基因Eml5mRNA

6、,HSPBAPlmRNA和HSPAl2AmRNA的Cy5／Cy3比值分別為3．741、4．845和2．44l。 3FQ-PCR：樣品的三個(gè)孔道實(shí)時(shí)熒光曲線(xiàn)值基本擬合，CT(thresholdcycle)值接近，檢測(cè)結(jié)果顯示Eml5mRNA，HSPBAPlmRNA和HSPAl2AmRNA在耐藥性癲癇腦組織中的表達(dá)量均高于正常對(duì)照組。 4免疫組化：發(fā)現(xiàn)Eml5和HSPBAPl蛋白在耐藥性癲癇顳葉和海馬中高表達(dá)，與對(duì)照組相同部

7、位的光密度(opticaldensity，OD)值比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。 5Westernblot：耐藥性癲癇顳葉和海馬中Eml5和HSPBAPl的蛋白表達(dá)量均高于相同部位的對(duì)照組。 結(jié)論： 1基因芯片在篩選耐藥性癲癇相關(guān)差異基因表達(dá)時(shí)，具有快速、高通量、高靈敏度等特點(diǎn)。通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)耐藥性癲癇患者術(shù)后腦組織差異表達(dá)基因的測(cè)定，可為耐藥性癲癇的發(fā)病機(jī)制從基因水平上提供依據(jù)。 2基因

8、水平和蛋白水均證實(shí)Eml5和HSPBAPl在耐藥性癲癇患者腦組織中的表達(dá)量高于對(duì)照組。HSPAl2AmRNA在耐藥性癲癇腦組織中的表達(dá)量高于對(duì)照組，F(xiàn)Q-PCR與基因芯片結(jié)果一致。 3耐藥性癲癇的主要病理改變是海馬苔蘚纖維發(fā)芽，Eml5蛋白表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突和軸突延伸，觸發(fā)海馬苔蘚纖維發(fā)芽，最終導(dǎo)致病理性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重組和興奮性突觸重構(gòu)。 4耐藥性癲癇患者腦組織中HSPBAPl的高表達(dá)可能抑制了熱休克蛋白27(hea

9、tshockprotein27，HSP27)的神經(jīng)元保護(hù)功能，促進(jìn)細(xì)胞色素C-caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程；激活Fas介導(dǎo)的依賴(lài)Daxxf一種Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白)的JNK／SAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。HSPBAPl阻礙了磷酸化HSP27對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合作用的抑制，間接加強(qiáng)了微絲組裝，觸發(fā)海馬苔蘚纖維發(fā)芽。 5HSPAl2AmRNA表達(dá)上調(diào)可能在耐藥性癲癇發(fā)病機(jī)制中起重要作用，我們認(rèn)為HSPAl2A可能作為重