鹽酸小檗堿通過SortaseA和Esp途徑影響糞腸球菌生物被膜的初步探討.pdf

1、1.糞腸球菌生物被膜形成的動態(tài)觀察及早期相關(guān)基因的表達(dá)研究
　　 目的:建立糞腸球菌生物被膜(biofilm，BF)體外模型，觀察生物被膜形成發(fā)展過程中空間立體結(jié)構(gòu)上的動態(tài)變化;探討sortaseA（轉(zhuǎn)肽酶A編碼基因）基因、esp（腸球菌表面蛋白）與糞腸球菌生物被膜形成早期的相關(guān)性，以利于臨床尋找藥物靶點(diǎn)，提高用藥效率。
　　 方法:
　　 (1)臨床篩選并鑒定尿路感染相關(guān)性糞腸球菌生物被膜菌，分為生物被膜菌組及

2、生物被膜陰性組，結(jié)晶紫染色法定量檢測生物被膜量。
　　 (2)采用玻片法體外建立糞腸球菌生物被膜模型，分別培養(yǎng)1、8、16、24、48及72h，利用激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)及熒光顯微鏡動態(tài)觀察生物被膜形成發(fā)展過程中的空間結(jié)構(gòu)變化。
　　 (3)利用實(shí)時(shí)定量PCR方法相對定量檢測esp、sortaseA在生物被膜早期菌和生物被膜陰性菌中的表達(dá)差異，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 (1)本院99例

3、尿路感染患者導(dǎo)尿管中共篩選出生物被膜菌36株，陽性率36.4％。其中糞腸球菌占生物被膜菌的27.8％。
　　 (2)結(jié)晶紫染色定量顯示菌株在1、8、16h生物被膜逐漸形成，24h趨于頂峰，隨后生物被膜量回落，48h有減少，72h進(jìn)一步減少。
　　 (3)菌株培養(yǎng)在16小時(shí)基本形成，24小時(shí)成熟，48小時(shí)有播散。隨著生物被膜形成過程的進(jìn)展，死菌量及活菌量逐漸增多，到48h開始有所減少;細(xì)菌總量由粘附面到游離面逐漸減少;中間

4、層活菌量密度最高。
　　 (4) sortaseA、esp基因的表達(dá)與糞腸球生物被膜菌形成早期具有相關(guān)性。生物被膜早期菌組sortaseA、esp表達(dá)量分別是生物被膜陰性菌組的7.9與13.5倍。
　　 小結(jié):
　　 (1)本研究細(xì)菌尿路感染中，生物被膜菌檢出率為36.3％.其中以糞腸球菌所占生物被膜菌比例最大(27.8％)。這一結(jié)果與我們實(shí)驗(yàn)室三年前研究的結(jié)論基本一致，提示本院在近三年留置導(dǎo)尿管相關(guān)的尿路感染生

5、物被膜菌分布變化不明顯。
　　 (2)利用熒光顯微鏡及CLSM觀察，證實(shí)了糞腸球菌BF形成和發(fā)展經(jīng)歷了最初的定植及不可逆黏附等早期階段、結(jié)構(gòu)分化階段、發(fā)展成熟階段、和解聚再定植階段。細(xì)菌總量由粘附面到游離面逐漸減少;中間層活菌量密度較高。
　　 (3) sortaseA、esp基因與糞腸球生物被膜菌形成早期密切相關(guān)，在生物被膜形成早期上調(diào)。
　　 2.鹽酸小檗堿對糞腸球菌生物被膜形成的影響
　　 目的:研

6、究鹽酸小檗堿對糞腸球菌生物被膜形成的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　 方法:以生物被膜量較強(qiáng)的菌株EF06為研究對象，將鹽酸小檗堿處理菌株EF06的不同分為兩組，甲組為不同濃度鹽酸小檗堿與EF06共同孵育24h;乙組為EF06培養(yǎng)24h后與不同濃度鹽酸小檗堿再共培24h。熒光顯微鏡觀察藥物未處理組和處理組之間的差異。結(jié)晶紫染色法定量檢測不同處理組內(nèi)生物被膜形成量和生物被膜量的差異，做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　

7、 (1)熒光顯微鏡檢測，甲處理組中鹽酸小檗堿作用濃度在20μg/ml和40μg/ml時(shí)，EF06細(xì)菌密度略高于藥物未處理組，但隨著藥物濃度的增加，細(xì)菌密度逐漸減少。乙處理組鹽酸小檗堿作用濃度在200，400和600μg/ml時(shí)，生物被膜結(jié)構(gòu)上未見明顯的變化，當(dāng)達(dá)到800μg/ml時(shí)生物被膜厚度有所減少，達(dá)到1000μg/ml，生物被膜厚度減少明顯。
　　 (2)結(jié)晶紫染色定量測得OD600值。在甲組，藥物濃度為20、40μg/m

8、l與0μg/ml比較，p＞0.05;藥物濃度60、80和100μg/ml與0μg/ml比較，p＜0.05;藥物濃度60、80與100μg/ml之間兩兩比較，p＜0.05，前者大于后者。在乙組，藥物濃度為200、400及600μg/ml與0μg/ml比較，p＞0.05，藥物濃度800和1000μg/ml與0μg/ml比較，p＜0.05，藥物濃度800與1000μg/ml比較，p＜0.05，前者大于后者。
　　 小結(jié):