腸球菌efaA基因陽性轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建及其對生物膜形成影響的初步探討.pdf

1、目的：構(gòu)建pAT28+efaA+His重組子和腸球菌efaA-對照株及efaA+轉(zhuǎn)化株，為進(jìn)一步探討efaA基因的功能，防治腸球菌感染奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、腸球菌efaA-對照株及efaA+轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建及鑒定：
　　 1.用PCR從腸球菌標(biāo)本中篩選出efaA-/gel-/cyl-野生株(本實驗室保存)；
　　 2.用氯化鈣共沉淀法將空質(zhì)粒pAT28轉(zhuǎn)化到野生株作為對照株；
　　 3.

2、構(gòu)建pAT28+efaA重組子并轉(zhuǎn)化到野生株做為轉(zhuǎn)化株：Genebank中獲得efaA基因全長，PCR擴(kuò)增efaA基因片段，用基因克隆技術(shù)構(gòu)建pAT28+efaA重組載體，用氯化鈣共沉淀法將重組子轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩、PCR鑒定、雙酶切鑒定、測序，將測序正確的重組子轉(zhuǎn)化到野生株做為轉(zhuǎn)化株，IPTG誘導(dǎo)efaA基因表達(dá)， SDS-PAGE、Western Blot分析鑒定。
　　 二、efaA基因?qū)δc球菌生物膜

3、形成影響的初步探討
　　 用半定量可見光測定OD值的方法檢測efaA-野生株、空質(zhì)粒pAT28對照株以及efaA+轉(zhuǎn)化株(大約5×106-10×106 CFU)在96孔板分別靜止培養(yǎng)3 h、24 h后形成的生物膜OD595，通過比較efaA基因轉(zhuǎn)化入腸球菌野生株前后生物膜形成能力差異，探討efaA基因?qū)ι锬ば纬傻挠绊憽?br>　　 結(jié)果：1.對照株(空質(zhì)粒pAT28轉(zhuǎn)野生株)在含壯觀霉素(終濃度500μg/ml)的ELB培養(yǎng)

4、平板上培養(yǎng)可見菌落生長；轉(zhuǎn)化株(pAT28+efaA重組子轉(zhuǎn)野生株)在IPTG/X-Gal的壯觀霉素(終濃度500μg/ml)ELB培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，可見白色菌落生長，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE、Western Blot分析，可見在35kd附近有一條帶；2.早期黏附測定與生物膜形成實驗中，轉(zhuǎn)化株粘附在96-孔板底部形成的生物膜OD595值均比野生株及對照株大。
　　 結(jié)論：1.成功構(gòu)建出腸球菌efaA-對照株及efaA+