IL-4受體拮抗體對哮喘小鼠氣道炎癥及Th失衡干預(yù)作用的實驗研究.pdf

1、第一部分：一種改良型小鼠哮喘模型的建立及評價 哮喘動物模型一直是哮喘研究的重要手段和工具，也是本研究的重要基礎(chǔ)和平臺。為此我們選擇遺傳背景清楚，所需試劑易購價廉的BALB/c小鼠建立哮喘模型。結(jié)合文獻報道，通過控制實驗動物條件、改良致敏劑及致敏方法等，摸索出一種新的、效果良好的小鼠哮喘模型建立方法，為后續(xù)研究提供很好的工具和手段。 目的：建立一種改良型小鼠哮喘模型并評價其效果。 方法：SPF級雌性BALB/c小鼠

2、20只，隨機分為模型組和對照組，模型組于第0和14d(腹腔+皮下)注射100μgOVA(卵清蛋白)致敏，第21～30d霧化吸入5％OVA激發(fā)，對照組則用生理鹽水替代。 結(jié)果：模型組小鼠在激發(fā)過程中出現(xiàn)明顯呼吸加深加快，點頭呼吸，安靜少動，弓背直立，二便失禁等哮喘急性發(fā)作表現(xiàn)。BALF (支氣管肺泡灌洗液)中白細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞分類明顯增多。血清及BALF中IL-4明顯增高，INF-γ降低，OVA特異性IgE增高。肺組織病理切

3、片見細支氣管及伴行血管周圍有較多炎癥細胞浸潤，嗜酸性粒細胞聚集，杯狀細胞增生，粘液分泌增加，平滑肌增生肥厚，部分肺泡間隔斷裂形成肺氣腫。 結(jié)論：通過對方法的改良，成功建立小鼠哮喘動物模型，為后續(xù)研究提供了很好的工具和手段。 第二部分：攜帶mIL-4RA基因重組載體的構(gòu)建及在氣道上皮細胞株9HTE中的表達 目的：構(gòu)建增強型綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的mIL-4RA真核表達質(zhì)粒，并檢測其在氣道上皮細胞株9HTE中的表達。

4、 方法：RT-PCR方法獲取mIL-4RA cDNA，亞克隆至pMD-18 Tsimple 質(zhì)粒中。經(jīng)測序鑒定后，用 PCR 方法擴增目的基因，并加上Kozak 序列，起始和終止密碼，亞克隆至 pIRES2-EGFP 質(zhì)粒中，構(gòu)建含mIL-4RA基因的真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP/mIL-4RA。經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定正確后轉(zhuǎn)染9HTE細胞，通過熒光蛋白的表達實時監(jiān)測mIL-4RA在9HTE細胞內(nèi)的表達，并用ELISA方

5、法進行定量。 結(jié)果：經(jīng)核苷酸序列測定及PCR方法，鑒定成功獲得含mIL-4RA基因的重組真核表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP/mIL-4RA。通過熒光倒置顯微鏡觀察到質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后6小時即有熒光蛋白表達，熒光強度在轉(zhuǎn)染后48小時達高峰。ELISA方法檢測到mIL-4RA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染9HTE細胞培養(yǎng)上清中mIL-4RA表達量為30.6±8.2pg/ml，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染9HTE細胞培養(yǎng)上清中mIL-4RA表達量為2.5±1.2pg/ml，兩

6、者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：本部分成功構(gòu)建含mIL-4RA基因的重組真核表達質(zhì)粒，且該質(zhì)?？稍跉獾郎掀ぜ毎?HTE中成功表達mIL-4RA蛋白，為后續(xù)免疫基因治療提供了重要前提和基礎(chǔ)。 第三部分：氣管內(nèi)滴注mIL-4RA重組載體對哮喘小鼠氣道炎癥及Th失衡的干預(yù)作用 目的：通過氣管內(nèi)滴注mIL-4RA的真核表達質(zhì)粒，觀察對哮喘小鼠氣道炎癥及Th失衡的干預(yù)作用。 方法：SPF級BALB/c小鼠48只，

7、隨機分為正常對照組、哮喘模型組、mIL-4RA質(zhì)粒干預(yù)組和空質(zhì)粒對照組。哮喘模型組用OVA致敏和激發(fā)(方法同第一部分)；正常對照組用生理鹽水替代；mIL-4RA質(zhì)粒干預(yù)組于第一次致敏當(dāng)天，氣管內(nèi)滴注mIL-4RA真核表達質(zhì)粒10μg，余處理同模型組；空質(zhì)粒對照組于第一次致敏當(dāng)天，氣管內(nèi)滴注空pIRES2-EGFP質(zhì)粒10μg，余處理同模型組。觀察小鼠的哮喘發(fā)作情況，肺組織病理切片檢測肺部病理損害，支氣管肺泡灌洗檢測BALF中白細胞總數(shù)及

8、嗜酸性粒細胞分類，ELISA方法檢測BALF及血清中Th1，Th2類細胞因子水平，免疫組化法檢測肺組織原位Th1，Th2類細胞因子水平，免疫熒光法檢測肺組織磷酸化-STAT6的水平，流式細胞術(shù)檢測外周血、肺及脾臟中CD3<'+>CD4<'+>TL細胞和CD3<'+>CD8<'+>TL 細胞比值。 結(jié)果：與空質(zhì)粒對照小鼠比較，氣管內(nèi)滴注mIL-4RA真核表達質(zhì)?？擅黠@減輕小鼠的急性哮喘發(fā)作癥狀；減輕氣道炎癥和嗜酸性粒細胞浸潤；減輕

9、肺部病理損害；降低氣道局部 Th2 類細胞因子 IL-13 的水平(p<0.01)，增加氣道局部Th1類細胞因子INF-γ的水平(p<0.01)；下調(diào)血清中IL-13的水平(p<0.01)，但對血清中INF-γ的水平?jīng)]有明顯調(diào)節(jié)作用(p>0.05)；可降低肺組織磷酸化-STAT6水平；氣管內(nèi)滴注mIL-4RA真核表達質(zhì)粒對哮喘小鼠外周血、肺及脾臟中CD3<'+>CD4<'+>TL細胞和CD3<'+>CD8<'+>TL細胞比值沒有明顯影響

10、(p>0.05)。 結(jié)論：氣管內(nèi)滴注mIL-4RA真核表達質(zhì)?？删罪@減輕小鼠急性哮喘發(fā)作癥狀，減輕肺部炎癥和嗜酸性粒細胞浸潤；調(diào)節(jié)氣道局部Th失衡，但對于體液Th失衡調(diào)節(jié)作用有限；可降低肺組織Th2類轉(zhuǎn)錄因子STAT6磷酸化水平；但對哮喘小鼠外周血、肺及脾臟中CD3<'+>CD4<'+>TL細胞和CD3<'+>CD8<'+>TL 細胞比值均沒有明顯影響。 第四部分：腹腔注射mIL-4RA重組載體對哮喘小鼠氣道炎癥及Th失

11、衡的干預(yù)作用 目的：通過腹腔注射mIL-4RA真核表達質(zhì)粒，觀察對哮喘小鼠氣道炎癥及Th失衡的干預(yù)作用。 方法：SPF級：BALB/c小鼠48只，隨機分為正常對照組、哮喘模型組、mIL-4RA質(zhì)粒干預(yù)組和空質(zhì)粒對照組。哮喘模型組用OVA致敏和激發(fā)(方法同第一部分)；正常對照組用生理鹽水替代；mIL-4RA重組質(zhì)粒干預(yù)組分別于第一次和第二次致敏當(dāng)天，腹腔注射mIL-4RA真核表達質(zhì)粒各50μg，余處理同模型組；空質(zhì)粒對照組

12、于第一次和第二次致敏當(dāng)天，腹腔注射空pIRES2-EGFP質(zhì)粒各50μg，余處理同模型組。觀察小鼠的哮喘發(fā)作情況，肺組織病理切片檢測肺部病理損害，支氣管肺泡灌洗檢測BALF中白細胞總數(shù)及嗜酸性粒細胞分類，ELISA方法檢測BALF及血清中Th1，Th2類細胞因子水平，免疫組化法檢測肺組織原位Th1，Th2類細胞因子水平，免疫熒光法檢測肺組織局部磷酸化-STAT6水平，流式細胞術(shù)檢測外周血、肺及脾臟中CD3<'+>CD4<'+>TL細胞和

13、CD3<'+>CD8<'+>TL細胞比值。 結(jié)果：與空質(zhì)粒對照小鼠比較，腹腔注射mIL-4RA真核表達質(zhì)粒亦可明顯減輕小鼠急性哮喘發(fā)作癥狀；減輕肺部炎癥和嗜酸性粒細胞浸潤；減輕肺部病理損害；不但可降低氣道局部Th2類細胞因子IL-13的水平(p<0.01)，增加Th1類細胞因子INF-γ的水平(p<0.01)；而且可下調(diào)血清中IL-13的水平(p<0.01)，增加血清中INF-γ的水平(p<0.01)；可降低肺組織磷酸化-STA

14、T6的水平；同樣腹腔注射mIL-4RA真核表達質(zhì)粒對哮喘小鼠外周血、肺及脾臟中CD3<'+>CD4<'+>TL細胞和CD3<'+>CD8<'+>TL細胞比值均沒有明顯影響(p>0.05)。 結(jié)論：腹腔注射mIL-4RA真核表達質(zhì)粒亦可明顯減輕小鼠哮喘急性發(fā)作癥狀；減輕肺部病理損害和炎癥；減輕氣道嗜酸性粒細胞浸潤；調(diào)節(jié)氣道局部和體液Th失衡；可降低肺組織磷酸化-STAT6水平；但對哮喘小鼠PBMC、肺及脾臟中CD3<'+>CD4<