卵巢癌早期診斷標(biāo)志物的蛋白組學(xué)分析及GRPsiRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞ES2生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf

1、1.研究背景
　　 卵巢癌是目前全球死亡率最高的婦科惡性腫瘤。究其因?yàn)?是因?yàn)槁殉驳慕馄饰恢秒[匿,早期卵巢癌常缺乏臨床癥狀,而造成患者就診時(shí)往往到了晚期,晚期病人的治療過(guò)程中,常發(fā)生耐藥和復(fù)發(fā),5年生存率只有15～20％,與晚期相比,早期癌的5年生存率高達(dá)80～90％,可見(jiàn)提高卵巢癌的5年生存率的關(guān)鍵在于發(fā)現(xiàn)更多的早期病人。由于缺乏相應(yīng)的高度特異性的標(biāo)志物,卵巢癌的早期診斷仍是其研究的一個(gè)瓶頸問(wèn)題,因此,卵巢癌的早期診斷仍是目前

2、研究的熱點(diǎn)。目前臨床上多采用陰道B超結(jié)合CA125早期診斷卵巢癌,但是盡管這樣也只能發(fā)現(xiàn)25％左右的早期病例,診斷性腹腔鏡能夠發(fā)現(xiàn)100％的卵巢癌病人,但是其有創(chuàng)傷性和昂貴的價(jià)格限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。卵巢癌早期診斷標(biāo)志物的研究中,多數(shù)學(xué)者采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行篩選,其最大的優(yōu)勢(shì)在于能夠從整體水平把握整個(gè)疾病的病理生理狀態(tài),傳統(tǒng)的蛋白組學(xué)方法有2-DE、多維凝膠電泳,但是這些方法的可重復(fù)性較低且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,近年來(lái)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)

3、譜和基質(zhì)輔助電離飛行時(shí)間質(zhì)譜兩大技術(shù)飛速發(fā)展,尤其是前者目前多用于血清標(biāo)志物的篩選,但其可重復(fù)性仍然較差,隨著研究的日益成熟,一些學(xué)者采用磁珠結(jié)合MALDI技術(shù)進(jìn)行腫瘤標(biāo)志物篩選的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)該方法的可重復(fù)性較高,認(rèn)為這與磁珠表面的疏水特性有關(guān)。
　　 較早的蛋白組學(xué)研究多采用血清標(biāo)本來(lái)進(jìn)行疾病蛋白質(zhì)的篩選,近年來(lái)隨著蛋白質(zhì)分離技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)生物信息學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,唾液、膽汁、腹水、囊液等體液也被用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)

4、組學(xué)的研究,目前多數(shù)研究仍集中在血清標(biāo)志物篩選上,但血清蛋白來(lái)自全身,器官特異性較低,很難從大多數(shù)無(wú)癥狀人群中捕獲盡可能多的真正患病的個(gè)體,相比較而言,各種體液蛋白質(zhì)組學(xué)研究所篩選的標(biāo)志物具有特異性高的優(yōu)勢(shì)。最近,雖有將卵巢癌患者的囊液和腹水用來(lái)篩選早期診斷標(biāo)志物的研究,但是將各個(gè)期別的卵巢癌作為一個(gè)研究組與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照研究,勢(shì)必會(huì)遺漏一些早期病變的標(biāo)志物。
　　 很顯然,將卵巢癌分為早期組和晚期組,并將血清、腹水和囊液相結(jié)合

5、用以篩選早期診斷的標(biāo)志物,將會(huì)大大提高所篩選標(biāo)志物的特異性和敏感性。因此本研究采用基于磁性微球的MALDI-TOF-MS、免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù),首先將卵巢癌患者分為早期組和晚期組分別與兩個(gè)對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)研究,進(jìn)一步在腹水和囊液中篩選卵巢癌相關(guān)侯選蛋白和早期診斷標(biāo)志物,從蛋白水平探討卵巢癌的血清和組織分子變化特征和規(guī)律,并采用小干擾RNA技術(shù)初步探討篩選標(biāo)志物的生物學(xué)功能,加深對(duì)卵巢癌癌變機(jī)制的了解,并為進(jìn)一步發(fā)掘卵巢癌早期發(fā)現(xiàn)

6、的分子指標(biāo)和手段提供重要的理論基礎(chǔ)和信息。
　　 2.材料與方法
　　 2.1研究對(duì)象
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn):
　　 血清:訓(xùn)練集血清:卵巢癌患者30例(其中Ⅰ～Ⅱ期11例,Ⅲ～Ⅳ19例,漿液性23例,粘液性6例,內(nèi)膜樣癌1例；<50歲9例,>50歲21例,家族史陽(yáng)性10例,家族史陰性20例)、良性卵巢腫瘤10例(其中漿液性8例,粘液性2例)和正常卵巢者13例的血清和配對(duì)組織,5例卵巢癌患者的腹水和囊液,

7、以上血清為訓(xùn)練集樣本,驗(yàn)證集血清:卵巢癌8例(其中Ⅰ～Ⅱ期2例,Ⅲ～Ⅳ期6例)、5例卵巢良性腫瘤(其中漿液性4例,粘液性1例)和5例正常卵巢者的血清作為驗(yàn)證集樣本。
　　 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn):
　　 卵巢癌和正常卵巢組織為與以上訓(xùn)練集血清配對(duì)的組織共43例,良性卵巢腫瘤組織20例(與訓(xùn)練集血清配對(duì)組織10例,與驗(yàn)證集血清配對(duì)組織5例和額外收集組織5例)。
　　 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn):
　　 卵巢癌和正常卵巢組為

8、訓(xùn)練集加驗(yàn)證集血清共56例,良性卵巢腫瘤組25例(除訓(xùn)練集10例外,額外收集10例也作為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集5例)。
　　 小干擾RNA實(shí)驗(yàn):
　　 細(xì)胞:人卵巢癌細(xì)胞系ES2細(xì)胞
　　 2.2樣本(血清和組織)收集
　　 在2006年7月至2009年1月收集術(shù)前目清晨空腹血5ml,離心后-80℃保存待用。組織均取自術(shù)中,10％福爾馬林固定,石蠟包埋并以蠟塊室溫保存。所有病人術(shù)前均排除內(nèi)外科合并癥和腎功能不全,

9、未經(jīng)過(guò)放化療和免疫治療。術(shù)中收集腹水和囊液標(biāo)本并避免被血液污染。
　　 2.3方法
　　 2.3.1MALDI-TOF-MS結(jié)合磁性微球(磁珠)檢測(cè)血清蛋白質(zhì)組
　　 2.3.1.1樣品制備
　　 取5μl血清樣品,加入弱陽(yáng)離子磁珠WCX(Bruker Daltonics,Leipzig
　　 Germany)混懸液SPE-CM2μl以及SPE-CB95μl,磁珠結(jié)合并貼壁后移去上清,再加入SPE

10、-CW100μl,反復(fù)重復(fù)操作兩次,得到制備好的血清樣品。腹水和囊液的上樣量分別為10μL和2.5μL,操作步驟和血清樣品制備相同。
　　 2.3.1.2MicroflexMALDI-TOF質(zhì)譜分析
　　 將1μl含蛋白質(zhì)的洗脫液與10μl基質(zhì)(0.3％的-α-氰基-4-羥基肉桂酸,HCCA)混合,取1μl點(diǎn)樣于Anchorchip靶板上,將耙板放入Microflex質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics),用標(biāo)準(zhǔn)品(

11、Clinprot standard)校正儀器后檢測(cè)樣品,獲得不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)峰構(gòu)成的質(zhì)譜圖。在血清、腹水和囊液中篩選共同升高的多肽峰。然后在http//us.expasy.ory/tools/tagident.html數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與之匹配的多肽。根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道,甄別篩選出候選多肽進(jìn)行下一步驗(yàn)證。
　　 2.3.2卵巢癌差異表達(dá)多肽的血清和組織驗(yàn)證
　　 2.3.2.1免疫組化(IHC)
　　 采用免疫組化SP

12、法檢測(cè)卵巢癌組織、良性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織的相應(yīng)多肽的表達(dá)。GRP抗體(rabbit polyclonal,MAB35841 R&D Co,Ameraican')和二抗、DAB試劑盒均購(gòu)自上海越研生物工程公司。實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
　　 2.3.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EIJSA)
　　 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌組、良性卵巢腫瘤組和正常卵巢組的血清相應(yīng)多肽的水平差異。GRP ELISA試劑盒(QC01-

13、1,R&D Co,American)購(gòu)自上海越研生物工程公司。Pro-GRP試劑盒(H23517,Ⅳ,American)。實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行
　　 2.3.3GRPsiRNA對(duì)人卵巢癌ES2細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)
　　 構(gòu)建針對(duì)GRP的發(fā)夾樣siRNA真核表達(dá)載體,人工合成GRPsiRNA的寡核苷酸鏈,導(dǎo)入p-Genesil-1.1載體(p-Genesil-1-1載體購(gòu)自武漢晶賽生物技術(shù)工程公司),采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入人卵巢

14、癌細(xì)胞系ES2細(xì)胞中,采用免疫印跡法(Westernbloting)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后GRPmRNA和蛋白表達(dá)變化,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)觀察被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡情況；transwell小室觀察細(xì)胞被轉(zhuǎn)染前后的穿膜侵襲力。
　　 2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和生物信息學(xué)分析
　　 采用ClinProtTM(Bruker Daltonics Company)的內(nèi)置軟件FlexAna

15、lysis3.0收集所有樣品的質(zhì)譜峰,并分析單個(gè)峰的強(qiáng)度。采用Top Hat和Savitsky Golay系統(tǒng)進(jìn)行平滑、去噪和歸一化處理后采用遺傳算法對(duì)多肽峰進(jìn)行量化。采用ClinProtTM軟件(Ver.2.2；Bruker Daltonics)將所有信噪比(S/N)>5的1000-10000Da范圍內(nèi)的信號(hào)進(jìn)行處理。通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)的P值評(píng)價(jià)每個(gè)差異峰的在不同組別的表達(dá)強(qiáng)度差異。采用線性支持向量機(jī)(SVM)區(qū)分各

16、組的數(shù)據(jù)并建立診斷模型,以留一法分析診斷模型的診斷敏感度和特異度。篩選出的多肽峰的診斷意義用樣品分布圖和均值標(biāo)準(zhǔn)差圖來(lái)表示。免疫組化的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的結(jié)果分別用x2檢驗(yàn)和方差分析(q-檢驗(yàn))、Kruskal-Wallis法進(jìn)行分析。分別采用Spearman相關(guān)性分析評(píng)價(jià)卵巢癌組的免疫組化和ELISA結(jié)果一致性和Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)GRP和pro-GRP這兩個(gè)血清指標(biāo)的相關(guān)性,計(jì)算ELISA結(jié)果的95％的可信區(qū)間和敏感度、特異度

17、、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。以Pearson相關(guān)系數(shù)表示差異多肽峰和血清多肽水平的相關(guān)性。各組的轉(zhuǎn)染前后的蛋白、基因表達(dá)水平的變化和增殖、侵襲力變化采用兩樣本t檢驗(yàn)分析。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0數(shù)據(jù)包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 3結(jié)果
　　 3.1MALDI-TOF-MS檢測(cè)血清、腹水和囊液樣本
　　 卵巢癌組、良性組和正常組三組比較分析:良性與正常組相比無(wú)差異峰。與良性組相比,早、晚期卵巢癌組共同升高的多肽峰有2

18、881和2897Da(P<0.05)；與正常組相比,早、晚期卵巢癌組共同升高的多肽峰有2881,2897和4466Da(P<0.05)。在4例卵巢癌患者的腹水和囊液中也發(fā)現(xiàn)2881和2897Da.多肽峰均值較高。選擇早晚期卵巢癌患者血清、腹水和囊液中共同升高的2881和2897Da差異峰采用GC算法建模,經(jīng)留一法驗(yàn)證,診斷卵巢癌的特異度為100％,敏感度為100％,盲法檢測(cè)的診斷特異度為100％,敏感度為87.5％。
　　 3.

19、2年齡與家族史相關(guān)候選多肽的篩選
　　 年齡<50歲和>50歲卵巢癌組與正常卵巢組相比無(wú)明顯差異多肽峰(P均>0.05),家族史陽(yáng)性與陰性的卵巢癌患者,血清多肽譜與正常卵巢組相比,僅有兩個(gè)下調(diào)的多肽峰2953和1466Da一致(P<0.05),其余差異多肽峰均不同。
　　 3.3卵巢癌早診候選多肽的檢索與篩選
　　 在http://us.expasy.org/tools/tagident.html數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與2

20、881和2897Da匹配的多肽,依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及文獻(xiàn)檢索結(jié)果,在9種卵巢癌候選相關(guān)差異多肽中,僅胃泌素釋放肽(Gastrin-releasing peptide,GRP)在既往報(bào)道中較多提示與腫瘤密切相關(guān),其余均未見(jiàn)報(bào)道與腫瘤有關(guān)。
　　 3.4免疫組化和ELISA.的組織和血清驗(yàn)證
　　 免疫組化結(jié)果顯示,與良性(30％)和正常組(0％)相比,GRP在卵巢癌組織中顯著高表達(dá)(早期:72.73％;晚期:78.95％),差

21、異有顯著性(x2=24.599,P=0.00)。ELISA結(jié)果顯示GRP在卵巢癌血清中顯著高于良性和正常卵巢組(P<0.05)。Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)顯示,卵巢癌患者的血清2881和2897Da差異多肽峰均值和標(biāo)準(zhǔn)差與GRP血清水平有明顯相關(guān)性(r=0.92；r=0.88；P均<0.0001)。此外,卵巢癌組織和血清中的GRP呈正相關(guān)且一致性較高(r=0.809,P=0.000),GRP與其前體pro-GRP在訓(xùn)練集人群中有明顯的相關(guān)

22、性(r=0.90,P<0.001),且pro-GRP在訓(xùn)練集人群血清中的水平顯著高于另外兩組(x2=41.81,P=0.00),其作為診斷指標(biāo)的ROC面積為0.974(z=27.88,P<0.001),cut-off值為89.2851,用于診斷卵巢癌的靈敏度為100％,特異度為90.91％,Youden指數(shù)為0.9091。對(duì)驗(yàn)證集人群進(jìn)行驗(yàn)證的靈敏度為93.33％,特異度為80％,Youden指數(shù)為0.7333。
　　 3.5G

23、RPsiRNA對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系ES2生物學(xué)功能的作用
　　 成功構(gòu)建人GRP的發(fā)夾樣siRNA真核表達(dá)載體GRPsiRNA,轉(zhuǎn)染ES2細(xì)胞后,其增殖能力明顯下降(P<0.05)；表達(dá)GRPmRNA和蛋白明顯降低并且凋亡率顯著下降；transwell小室顯示其穿膜侵襲能力明顯下降(P<0.05)。
　　 4結(jié)論
　　 4.1在早、晚期卵巢癌患者的血清中共同升高并在腹水和囊液也發(fā)現(xiàn)均值較高的2881和2897Da.差