枇杷花藥胚狀體的發(fā)生組織學、農桿菌介導轉化和EMS誘變研究.pdf

1、本試驗從組織學方面研究枇杷花藥胚狀體的起源，探討以枇杷花藥胚狀體為受體進行外源基因的轉化方法，初步建立以農桿菌介導的枇杷花藥胚狀體為受體的外源基因轉化方法，將外源基因CycD2引入了枇杷。同時以枇杷花藥胚狀體為材料，采用不同濃度的EMS和不同處理時間進行化學誘變，并對誘變處理后的枇杷花藥胚狀體進行RAPD分析，旨在獲得突變體，為豐富枇杷育種新材料奠定一定的理論和技術基礎。主要結果如下： 1．組織學研究證實，花藥胚的發(fā)育經歷球形胚

2、，心形胚，魚雷形胚及子葉形胚的發(fā)育歷程。在心形期與魚雷形期胚之間，胚內開始形成維管束組織；到魚雷形期，維管束組織進一步發(fā)育，開始形成V字形維管束；當胚發(fā)育到子葉形期時，維管束組織進一步完善，形成明顯的V字形維管束。 次生胚發(fā)生以間接途徑進行時，次生胚發(fā)生的起源為內起源。在愈傷組織內部，胚性細胞(染色過程中著色深，具有明顯的細胞核，體積較小，細胞結構緊密，細胞質濃，分裂旺盛)的細胞壁增厚，與其它細胞隔離開，形成相對獨立的單細胞原胚

3、或多細胞原胚；緊接著細胞進行分裂，形成二細胞原胚、四細胞原胚和多細胞原胚。胚性細胞在進行第一次分裂后就建立了極性，分裂形成的胚性細胞團內部結構緊密，與周圍其它細胞相對隔離。 當次生胚發(fā)生以直接接途徑進行時，次生胚發(fā)生的起源為外起源。即在子葉胚的中胚軸到下胚軸之間的表皮細胞開始分裂，分化形成胚性細胞，胚性細胞分化形成二細胞原胚，四細胞原胚及多細胞原胚，多細胞原胚進一步分化，在胚的中胚軸到下胚軸的表明形成凸起的球形胚，球形胚進一步發(fā)

4、育形成心形胚，魚雷形胚及子葉形胚。 2．安必西林適用于對轉化枇杷花藥胚狀體的篩選。枇杷花藥胚狀體與農桿菌EHA52共培養(yǎng)后轉移到選擇培養(yǎng)基上，所選用的四種抗菌素中安必西林、噻孢霉素和硫酸慶大霉素對農桿菌的抑制效果較好，羧芐青霉素不能有效抑制農桿菌EHA52的生長。與不含抗菌素的培養(yǎng)基相比，抗菌素的加入均降低枇杷花藥胚狀體的增殖率。安必西林在所測試的幾種抗菌素中不僅能很好的控制農桿菌EHA52的生長，而且對枇杷花藥胚狀體的生長和增

5、殖影響最小，噻孢霉素次之。硫酸慶大霉素雖然能夠很好地控制農桿菌EHA52的生長，但是由于它對枇杷花藥胚狀體有很強的毒害作用，導致枇杷花藥胚狀體褐化現(xiàn)象嚴重，生長和增殖都都受到嚴重影響，故不適用于對轉化枇杷花藥胚狀體的選擇。綜合各種因素認為安必西林的濃度在500mg/L～1000 mg/L適用于對轉化枇杷花藥胚狀體的篩選。 3.CycD2基因被成功轉入了枇杷花藥胚狀體。轉化后的枇杷花藥胚狀體增殖，采用CycD2特異引物對次生胚DN

6、A進行PCR擴增，電泳結果發(fā)現(xiàn)含有質粒CycD2的農桿菌DNA，經過遺傳轉化后的枇杷花藥胚狀體DNA在500～600bp有譜帶，而沒有經過轉化的枇杷花藥胚狀體的DNA則沒有相應的譜帶，表明CycD2基因已經轉入枇杷花藥胚狀體中。 4.經過EMS處理的枇杷花藥胚狀體生長和增殖能力下降。將枇杷花藥胚狀體轉入到含0.1％～0.9％EMS的溶液中振蕩0.5h，1h和2h。轉入培養(yǎng)基中觀察發(fā)現(xiàn)枇杷花藥胚狀體的死亡率很高，多數(shù)花藥胚狀體表面

7、變黑，褐化死亡，0.3％EMS處理0.5h的存活率最高為46.8％，0.7％EMS處理2h的枇杷花藥胚狀體存活率最低為2.8％。經過EMS處理的枇杷花藥胚狀體增殖能力顯著低于未經過處理的枇杷花藥胚狀體，分化的次生胚的生長和分化能力也變弱，同時分化的次生胚多以球形胚為主。 5.經過EMS處理的枇杷花藥胚狀體增殖，提取DNA，進行RAPD分析。經檢測，發(fā)現(xiàn)一些誘變處理過的胚狀體擴增的譜帶與對照譜帶發(fā)生了變化。從擴增圖譜可以看出：以s