尿路致病性大腸埃希菌持留相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、細(xì)菌感染治療領(lǐng)域，目前面臨以下兩大問題。一方面，全球抗菌藥物使用負(fù)荷不斷增大，不合理應(yīng)用甚至濫用抗菌藥物現(xiàn)象突出，日益嚴(yán)峻的細(xì)菌耐藥性問題成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。細(xì)菌耐藥性往往由于存在某些耐藥基因或固有基因發(fā)生突變而引起，細(xì)菌不僅可將耐藥性遺傳給子代細(xì)菌，而且可通過基因水平轉(zhuǎn)移而造成耐藥性的廣泛播散。耐藥細(xì)菌引起的感染已構(gòu)成抗感染治療的新挑戰(zhàn)，人們正逐漸陷入“無藥可用”的窘境。另一方面，臨床細(xì)菌感染治療過程中發(fā)現(xiàn)，某些病原菌，體外藥敏試驗(yàn)顯

2、示對(duì)抗菌藥敏感，但在體內(nèi)可耐受藥物的抗菌作用，并可躲避宿主的免疫防御體系，在宿主體內(nèi)長期存在，難以被徹底清除，成為持續(xù)感染、慢性感染或反復(fù)發(fā)作性感染的“原兇”，比如結(jié)核病，葡萄球菌菌血癥，尿路致病性大腸埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli，UPEC)引起的反復(fù)發(fā)作性尿路感染等，這一問題又帶來“有藥無效”的困惑。
　　 對(duì)抗菌藥物敏感的細(xì)菌難以被清除的這一特性稱之為持留(persistence)。廣

3、義而言，與細(xì)菌粘附相關(guān)的致病因子、生物膜的形成以及形成持留菌(persister)等因素，使得細(xì)菌難以被清除，均稱為“持留”。狹義的“持留”則是特指持留菌能耐受高濃度抗菌藥物以及各種環(huán)境應(yīng)激因素而存活的能力?；蛐屯耆嗤木褐械暮苌僖徊糠旨?xì)菌亞群能耐受大劑量抗菌藥物作用而存活下來，而在脫離抗菌藥物的環(huán)境后又可繁殖，這一細(xì)菌亞群的子代仍保持對(duì)該抗菌藥物的敏感性，這些存活下來的細(xì)菌稱之為持留菌。本文題目中的“持留”取其廣義含義，主要包括

4、與粘附因子相關(guān)以及與phoU基因相關(guān)的持留。
　　 尿路感染(Urinary tract infection，UTI)是最常見的感染性疾病之一，女性發(fā)病率遠(yuǎn)高于男性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，60％女性一生至少發(fā)生一次尿路感染，而25％急性膀胱炎的患者可反復(fù)發(fā)作。大腸埃希菌是尿路感染最常見的病原菌，70-95％的社區(qū)獲得性尿路感染和約50％的醫(yī)院獲得性尿路感染都由UPEC引起。在眾多致病因子中，粘附因子被認(rèn)為與UPEC難以被清除有關(guān)。UPEC的粘

5、附因子種類繁多，主要包括1型菌毛、P型菌毛、S/F1C菌毛、Afa/Dr粘附因子家族，以及某些與生物膜形成相關(guān)的粘附因子等。其中Afa/Dr粘附因子Afa可通過與泌尿道上皮細(xì)胞表面特異性受體的相互作用，介導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，躲避宿主對(duì)細(xì)菌的清除和部分抗菌藥物的殺菌作用；而進(jìn)入胞內(nèi)的細(xì)菌可大量繁殖，隨著泌尿道上皮更新脫落，胞內(nèi)大量細(xì)菌釋放，從而引起尿路感染再次發(fā)作，故認(rèn)為攜帶afa基因的UPEC容易引起尿路感染的反復(fù)發(fā)作。而粘附因子Pa

6、pG，由于其受體主要分布于腎臟，有研究認(rèn)為其主要與急性腎盂腎炎關(guān)系密切。flu基因編碼的粘附因子Ag43主要參與生物膜的形成，從而亦可使菌體難以被清除。
　　 除了粘附因子外，UPEC持留菌的形成，亦是病原菌難以被清除的一個(gè)重要方面。關(guān)于細(xì)菌形成持留的機(jī)制，至今尚不明確，目前普遍認(rèn)為是與持留菌低代謝狀態(tài)有關(guān)。2007年有研究在大腸埃希菌W3110菌株中發(fā)現(xiàn)了與持留相關(guān)的新基因--phoU，插入突變使該基因失活后，突變株能量代謝相

7、關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，細(xì)菌處于高代謝狀態(tài)，而對(duì)許多抗菌藥物以及各種應(yīng)激狀態(tài)的持留能力明顯下降，突變恢復(fù)后，菌株持留能力得以恢復(fù)。本課題組比對(duì)已公布的UPEC菌株phoU基因序列與野生株W3110 phoU基因序列發(fā)現(xiàn)：W3110phoU第236位氨基酸為甘氨酸G，而UPEC菌株，包括UTI189與CFT073、536等的phoU第236位突變?yōu)楣劝彼酔。本課題第三部分探討該氨基酸位點(diǎn)的突變對(duì)UPEC持留能力的影響。
　　 基于上述研

8、究背景，本課題收集華山醫(yī)院2008年1月至2009年12月尿路感染住院患者分離培養(yǎng)的UPEC47株，以及從健康志愿者肛拭子標(biāo)本培養(yǎng)分離大腸埃希菌26株，進(jìn)行菌株耐藥性、同源性分析、粘附因子基因以及phoU基因相關(guān)持留機(jī)制的研究，探索臨床尿路感染反復(fù)發(fā)作，UPEC菌株難以清除的機(jī)制；為開發(fā)新型尿路感染治療藥物提供理論基礎(chǔ)。本研究內(nèi)容包括以下三部分。
　　 第一部分 UPEC臨床株與腸道定植大腸埃希菌藥物敏感性試驗(yàn)與同源性分析

9、>　　 我們收集了2008年1月至2009年12月住院尿路感染患者尿液標(biāo)本中分離的47株UPEC，并從健康志愿者肛拭子標(biāo)本分離培養(yǎng)26株腸道定植大腸埃希菌作為對(duì)照。用瓊脂稀釋法測(cè)定哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和呋喃妥因等15種抗菌藥物對(duì)兩組菌株的最低抑菌濃度(Minimal Inhibitorty Concentra

10、tion，MIC)。根據(jù)2010年版CLSI(Clinical and Laboratory Standard Institute)藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)兩組菌株對(duì)各種抗菌藥物的敏感率和耐藥率。
　　 藥敏結(jié)果顯示，UPEC對(duì)大多數(shù)抗菌藥物的敏感性明顯低于腸道定植Ecoli菌株(P<0.05)。特別是對(duì)于臨床常用的氟喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星和左氧氟沙星)，UPEC的敏感率僅為23％，而腸道定植菌株的敏感率為96％；而對(duì)頭孢噻肟

11、，UPEC的敏感率僅為32％，而腸道定植菌為89％。但對(duì)哌啦西林/他唑巴坦、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星和呋喃妥因等藥物，UPEC仍有較高的敏感率(敏感率均在89％-100％之間)。
　　 根據(jù)2009年CLSI的規(guī)定，對(duì)頭孢噻肟MIC≥4μg/ml，頭孢他啶MIC≥16μg/ml的菌株，用CTX和CTX/CV，或CAZ和CAZ/CV雙紙片進(jìn)行產(chǎn)ESBLs菌株確證試驗(yàn)。結(jié)果47株UPEC中產(chǎn)ESBLs菌株為28株(60％)，而在

12、26株腸道定植大腸埃希菌菌株中發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)ESBLs菌株(4％)。產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)頭孢噻肟的耐藥率為100％，而對(duì)頭孢他啶的耐藥率為50％。用PCR方法對(duì)28株UPEC菌株進(jìn)行bla-CTX-M分型，其中14株(50％)屬于CTX-M-1組，12株(43％)屬于CTX-M-9組，CTX-M-1組菌株對(duì)頭孢他啶的耐藥率(86％)顯著高于CTX-M-9組(17％)。
　　 從大腸埃希菌MLST分型官方網(wǎng)站查詢并獲取七個(gè)管家基因adk

13、、fitmC、gyrB、icd、mdh、purA和recA的引物序列和PCR實(shí)驗(yàn)方案，擴(kuò)增47株UPEC菌株和26株腸道定植菌株上述7個(gè)管家基因片段，比對(duì)獲取等位基因編碼及ST型別，用eburst軟件分析菌株同源性并作圖。除5株UPEC和4株腸道定植大腸埃希菌同屬ST10型以及1株UPEC和1株腸道定植大腸埃希菌同屬ST453外，其他UPEC菌株MLST分型與腸道定植大腸埃希菌菌株完全不同。本研究47株UPEC菌株中最多見的ST型為國際

14、流行大腸埃希菌株ST131型(9株，19.1％)，其次依次為ST405(7株，14.9％)，ST10(5株，10.6％)，ST393(4株，8.5％)，ST69(4株，8.5％)以及ST95(3株，6.4％)。26株腸道定植大腸埃希菌菌株來自于22個(gè)不同ST型，分布更為分散，其中18個(gè)ST型在大腸埃希菌MLST官方網(wǎng)站資料庫已有記錄，另發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的ST型。ST10型在腸道定植大腸埃希菌中最為常見(4株，15.4％)，其次為一新發(fā)現(xiàn)ST型

15、(2株，7.7％)，其余20株均屬于20個(gè)不同的ST分型。
　　 第二部分 UPEC與正常人腸道定植大腸埃希菌粘附因子相關(guān)基因分析
　　 根據(jù)患者臨床資料，47株UPEC菌株分為反復(fù)發(fā)作性下尿路感染組(21例)、急性腎盂腎炎組(7例)和急性單純性膀胱炎組(19例)。用PCR方法檢測(cè)三組UPEC菌株以及健康志愿者腸道定植大腸埃希菌粘附因子基因afa、dra、daa、papG、flu、fimH、sfa和focG的攜帶情況。<

16、br>　　 ①共有6株UPEC菌株afa基因陽性，且該6株UPEC均屬于反復(fù)發(fā)作性下尿路感染UPEC菌株組(29％)，在健康人腸道定植大腸埃希菌菌株未檢測(cè)到afa基因攜帶株(P=0.004)。在所有實(shí)驗(yàn)菌株中均未發(fā)現(xiàn)攜帶draE或daaE基因的菌株。②47株UPEC菌株中11株(23％)papG基因陽性，其中10株為papGⅡ型，1株為papGⅢ型，另有1株腸道定植大腸埃希菌為papGⅡ型。papG基因在急性腎盂腎炎UPEC中的檢出率

17、達(dá)71％，顯著高于反復(fù)發(fā)作性下尿路感染組(14％)和急性單純性膀胱炎組(16％)(P=0.005)。③80.9％UPEC菌株與50.0％腸道定植菌株生物膜相關(guān)粘附因子flu基因陽性(P=0.006)。但3組UPEC菌株flu基因攜帶率無顯著差異。④UPEC中fimH基因檢出率為89.4％，而腸道定植菌株則為76.9％(P=0.155)。⑤反復(fù)發(fā)作性下尿路感染組、急性腎盂腎炎組和單純性膀胱炎組UPEC菌株中各有一株為sfa基因陽性，其中有

18、一株同時(shí)攜帶有focG基因。而健康中腸道定殖大腸埃希菌未檢測(cè)到sfa/foc基因。
　　 UPEC菌株攜帶粘附因子基因數(shù)多于腸道定植大腸埃希菌。76.6％的UPEC菌株攜帶2-3種粘附因子基因，而80.8％的腸道定植大腸埃希菌攜帶1-2種粘附因子基因。有1株(2.1％)UPEC菌株攜帶5種粘附因子基因，1株(2.1％)攜帶4種，但也有2株UPEC(4.3％)未檢測(cè)到粘附因子基因。
　　 產(chǎn)ESBLs UPEC菌株攜帶粘附

19、因子數(shù)少于非產(chǎn)ESBLs菌株。28株產(chǎn)ESBLsUPEC菌株中有2株(7％)未檢出任何粘附因子，6株(21％)檢出1種粘附因子，15株(54％)攜帶2種粘附因子，4株(14％)攜帶3種粘附因子，另有1株(4％)有4個(gè)粘附因子基因?yàn)殛栃?。?9株不產(chǎn)ESBLs UPEC菌株，僅含1種粘附因子基因的菌株為1株(5％)，分別有8株(42％)和9株(47％)攜帶2種和3種粘附因子基因，另有1株(5％)含有5種粘附因子基因。故產(chǎn)ESBLs UPE

20、C菌株的大多數(shù)(80％)所含粘附因子數(shù)目不多于2種，而超過一半(52％)的不產(chǎn)ESBLs UPEC菌株攜帶至少3種粘附因子基因(P=0.012)。
　　 第三部分 UPEC臨床分離株phoU基因相關(guān)持留機(jī)制研究
　　 為研究臨床分離UPEC菌株phoU基因相關(guān)持留機(jī)制，本部分研究首先用PCR方法擴(kuò)增比對(duì)47株UPEC臨床分離株和26株腸道定植大腸埃希菌phoU基因全長序列。47株UPEC菌株中10株(21％)為phoU基

21、因野生型(同W3110)，37株(79％)phoU基因?yàn)橥蛔冃?，其?0株為phoUG236E突變型(同CFT073、UTI89等UPEC菌株)，而17株為phoUS239P+D240K+K241E突變型。而26株腸道定植大腸埃希菌均為phoU基因野生型。
　　 UPEC菌株MLST型別與phoU基因型存在相關(guān)性。9株ST131 UPEC菌株均為phoUG236E突變型，7株ST405和4株ST393 UPEC菌株均為phoUS

22、239P+D240K十K241E突變型，而5株ST10 UPEC菌株則均為phoU基因野生型。另外，papG基因陽性菌株均為phoU突變型，且phoU突變型UPEC菌株所攜帶的粘附因子基因數(shù)多于phoU基因野生型UPEC菌株。但phoU基因型不同的UPEC菌株在引起尿路感染的類型和對(duì)主要抗菌藥物的敏感性等方面無明顯差異。
　　 為進(jìn)一步了解phoU基因突變型，尤其是phoUG236E突變型UPEC菌株與phoU野生型UPEC菌株

23、持留能力的差異，本研究用殺菌試驗(yàn)的方法，研究phoUG236E突變型UPEC菌株與phoU野生型UPEC菌株，在三種抗菌藥物頭孢他啶、阿米卡星和環(huán)丙沙星較高濃度作用下的持留情況。①頭孢他啶2×或4×MIC作用30小時(shí)后，phoU野生型UPEC菌落計(jì)數(shù)降至0，而phoU G236E突變型菌落計(jì)數(shù)仍有1.5×101CFU/ml；改用8×MIC頭孢他啶作用，在實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間(56h)內(nèi)phoUG236E突變型和phoU野生型菌株均能被殺滅，但p

24、hoU G236E突變型UPEC菌株被完全殺滅所需時(shí)間(44h)明顯長于phoU野生型UPEC菌株(20h)。②阿米卡星4×MIC作用20h后，完全殺滅phoU野生型UPEC菌株，而phoU G236E突變型UPEC菌落計(jì)數(shù)仍有1-7.5x101CFU/ml；增加藥物濃度至8×MIC，phoUG236E突變型UPEC亦能被完全殺滅，但時(shí)間(30h)明顯較phoU野生型(4h)延長。③環(huán)丙沙星8×MIC作用30h后，phoU野生型UPEC

25、被殺滅完全，而phoUG236E突變型仍有1-3.5×101CFU/ml；而增加藥物濃度于16×MIC，phoUG236E突變型可在藥物作用44h后被完全殺滅，而在藥物作用后4h，phoU野生型UPEC菌落計(jì)數(shù)已降為零。所以，在抗菌藥物作用下，phoUG236E突變型UPEC菌株的持留能力較phoU野生型UPEC菌株持留能力增加。
　　 為進(jìn)一步探討在抗菌藥物作用下，phoUG236E突變型UPEC菌株的持留能力較phoU野生型

26、UPEC菌株持留能力增加的機(jī)制，本研究用相對(duì)熒光定量PCR的方法測(cè)定在抗菌藥物作用下phoUG236E突變型和phoU野生型UPEC菌株phoU基因相對(duì)表達(dá)量(以管家基因mdh為內(nèi)參基因)。結(jié)果顯示：4×MIC頭孢他啶、4×MIC阿米卡星和8×MIC環(huán)丙沙星作用12h后，phoUG236E突變型UPEC菌株phoU基因相對(duì)表達(dá)量是phoU野生型UPEC菌株的6.2、20.6和6.8倍，即在上述三種抗菌藥物作用下，phoU G236E突變