產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌的耐藥性及相關(guān)耐藥機制.pdf

1、目的： 了解安徽省產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌對常用抗菌藥物的耐藥情況，揭示其相關(guān)耐藥機制，指導(dǎo)臨床合理用藥。 研究新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶的分子生物學(xué)特性。 材料與方法： 安徽省細菌耐藥性監(jiān)控中心收集2005年隨機月份35所醫(yī)院住院和門診患者的各種臨床送檢標(biāo)本，無重復(fù)分離的大腸埃希菌共402株。采用MH瓊脂倍比稀釋法對野生菌進行12種抗菌藥物的藥物敏感試驗。 經(jīng)頭孢西丁表型試驗進行初步篩選，對初

2、篩陽性及可疑陽性的細菌，采用三維試驗篩選高產(chǎn)AmpC酶株。對所有菌株通過多重PCR擴增質(zhì)粒介導(dǎo)ampC基因。對產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株用PCR方法檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因、l類整合子基因盒插入序列和主動外排系統(tǒng)acrAB-tolC基因，以揭示其是否存在多種耐藥機制。 將多重PCR陽性的菌株行轉(zhuǎn)移接合試驗，并行全編碼引物PCR擴增。對多次測序并經(jīng)GenBank比對后確定的產(chǎn)新酶菌株進行以下實驗：PCR擴增野生株和/

3、或轉(zhuǎn)移接合子中的AmpC型β-內(nèi)酰胺酶編碼基因片段，克隆入pUC-118載體，表達于感受態(tài)細胞大腸埃希菌JM109中，再次測定核苷酸序列，結(jié)果至GenBank比對，進行DNA序列分析。 將新酶全編碼基因克隆入表達載體pHSG398，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細胞大腸埃希菌JM109中，用加有抗菌藥物的瓊脂平板進行轉(zhuǎn)化株篩選。用瓊脂倍比稀釋法對野生株、接合子與轉(zhuǎn)化株同時進行MIC測定。 采用超聲破碎法進行產(chǎn)新酶細菌轉(zhuǎn)化株的粗酶提取，等電

4、聚焦電泳測定其等電點(pI)。對粗酶純化后，SDS-PAGE和考馬斯藍染色測定新酶分子量大小，進行酶促反應(yīng)動力學(xué)研究，以初步了解新酶的動力學(xué)特性。 采用Southern Blotting試驗再次驗證新酶是否由質(zhì)粒介導(dǎo)并定位其編碼基因所在質(zhì)粒大小。 結(jié)果： 檢出產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株28株(7.0％)。產(chǎn)酶菌株對12種常用抗菌藥物，除亞胺培南、美羅培南全部敏感外，對其他大多數(shù)抗菌藥物耐藥率均高于非產(chǎn)酶株。28株產(chǎn)

5、酶菌株中有23株表現(xiàn)為多重耐藥，20株檢測出各型ESBLs基因，21株擴增出1類整合子基因盒插入序列，20株主動外排系統(tǒng)acrAB-tolC基因陽性。 對402株大腸埃希菌用多重PCR檢測質(zhì)粒介導(dǎo)ampC基因，有28株陽性，再分別用單對引物對陽性株進行PCR擴增，結(jié)果顯示：CIT陽性11株，EBC陽性7株，DHA陽性7株，ACC陽性2株，MOX陽性1株。 對28株產(chǎn)酶菌PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)有兩株為

6、新的質(zhì)粒ampC基因型，其基因序列均已提交GenBank，獲得的登錄號分別為：EF054895，EF417572，其中一株所產(chǎn)新酶經(jīng)Jacoby GA同意并命名為MIR-4。 產(chǎn)新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株的轉(zhuǎn)移接合試驗和克隆表達試驗均取得成功，其野生株、接合子及轉(zhuǎn)化株的MIC結(jié)果顯示：野生株和接合子有著幾乎相同的耐藥譜，而轉(zhuǎn)化株對部分藥物的敏感性較前兩者明顯下降。 產(chǎn)新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶細菌轉(zhuǎn)化株的等電聚焦及SDS-P

7、AGE結(jié)果顯示，其等電點在8.2左右，蛋白質(zhì)分子量約為35kDa。Southern Blotting試驗再次證實了新酶由質(zhì)粒介導(dǎo)并定位其編碼基因位于54Kb的質(zhì)粒。 酶促反應(yīng)動力學(xué)研究，初步了解新酶對5種常用抗菌藥物的Km值和Vmax值，結(jié)果顯示：該酶對頭孢他啶的水解效率最低. 結(jié)論： 本地區(qū)產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶大腸埃希菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率均較高，多重耐藥現(xiàn)象普遍，同時存在多種耐藥機制，其中以產(chǎn)生滅活酶和

8、1類整合子介導(dǎo)的耐藥機制為主。對產(chǎn)酶株臨床經(jīng)驗用藥可選用碳青霉烯類、阿米卡星、四代頭孢菌素類抗菌藥物。 本地區(qū)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶以CIT，EBC，DHA型為主。經(jīng)對編碼基因比對分析后鑒定其中兩株為新型質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶，均是首次在安徽省被發(fā)現(xiàn)。產(chǎn)新酶菌株存在多種耐藥機制，且可通過質(zhì)粒在不同菌株之間傳遞，因此有必要加強本地區(qū)產(chǎn)質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶菌株的監(jiān)測并同其他地區(qū)進行耐藥資料的交換，以形成大的耐藥監(jiān)測網(wǎng)，這些工作對于阻止耐藥基因