細(xì)菌脂肽Pam3CSK4活化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Toll樣受體2上調(diào)MKP-1表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、目的:
　　Toll樣受體活化MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，MKP-1負(fù)向調(diào)節(jié) MAPK信號(hào)傳導(dǎo)抑制炎癥反應(yīng)。本研究通過(guò)分析活化TLR2誘導(dǎo)MKP-1表達(dá)及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑，闡明脂蛋白肽活化TLR2誘導(dǎo)可控炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，為臨床干預(yù)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展提供線索和依據(jù)。
　　方法:
　　利用DMEM和RPMI1640常規(guī)方法分別培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和人單核細(xì)胞（THP-1）至穩(wěn)定

2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。Pam3CSK4的劑量相關(guān)性分析濃度為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1μg/ml，時(shí)間相關(guān)性分析的劑量為1μg/ml，處理時(shí)間為0、1、3、6、12、24小時(shí)。細(xì)胞干預(yù)以后mRNA表達(dá)水平檢測(cè)采用RT-PCR方法，蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè)采用western blot方法。信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的濃度為10μM；信號(hào)傳導(dǎo)分子的磷酸性蛋白水平檢測(cè)采用Western blot方法。對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描半定量分析，所用統(tǒng)計(jì)學(xué)

3、方法使用t檢驗(yàn)，P值<0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度Pam3CSK4處理HUVCE細(xì)胞1小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示TLR2的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，具有劑量依賴性；
　　2.1μg/ml Pam3CSK4處理HUVEC細(xì)胞1-24小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示TLR2的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，具有時(shí)間依賴性；
　　3.不同濃度Pam3CSK4處理HUVCE細(xì)胞1小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)

4、果顯示促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和Cox-2的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，具有劑量依賴性；
　　4.1μg/ml Pam3CSK4處理HUVEC細(xì)胞1-24小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、MCP-1和Cox-2的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，具有時(shí)間依賴性；
　　5.不同濃度Pam3CSK4處理HUVCE細(xì)胞1小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示MKP-1的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，Western blot檢測(cè)

5、結(jié)果顯示MKP-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的上調(diào)，兩者上調(diào)均具有劑量依賴性；
　　6.1μg/ml Pam3CSK4處理HUVEC細(xì)胞1-24小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示MKP-1的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示MKP-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的上調(diào)，兩者上調(diào)具有時(shí)間依賴性；
　　7.不同濃度Pam3CSK4處理HUVCE細(xì)胞0.5小時(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示ERK、JNK、P38的磷酸性蛋白表

6、達(dá)水平上調(diào)，具有劑量依賴性；
　　8.不同濃度Pam3CSK4處理HUVCE細(xì)胞0.5小時(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示NF-κB抑制蛋白IκB-α的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，具有劑量依賴性；
　　9.10μM的U0126、SP600125、SB203580、和Bay117082處理HUVEC細(xì)胞30分種，然后再加入1μg/ml的Pam3CSK4刺激細(xì)胞1小時(shí)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示U0126、SB203580和Bay11

7、7082都明顯下調(diào)Pam3CSK4誘導(dǎo)的MKP-1表達(dá)；
　　10.不同濃度的SB203580作用于 HUVEC細(xì)胞30分鐘，再用1μg/ml的Pam3CSK4刺激細(xì)胞1小時(shí)，RT-PCR結(jié)果顯示隨著抑制劑SB203580的濃度增加，MKP-1的表達(dá)逐步下降，具有明顯的劑量相關(guān)性。
　　結(jié)論：:
　　1.血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞表達(dá)TLR2；
　　2.合成細(xì)菌脂肽Pam3CSK4活化TLR2誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子表達(dá)