海洋嗜殺酵母的篩選、嗜殺因子的純化及其基因的克隆.pdf

1、中國海洋大學博士學位論文海洋嗜殺酵母的篩選、嗜殺因子的純化及其基因的克隆姓名：王祥紅申請學位級別：博士專業(yè)：海洋生物指導教師：池振明20070528海洋嗜殺酵母的篩選、嗜殺園子的純化及其基園的克隆海洋嗜殺酵母的篩選、嗜殺因子的純化及其基因的克隆摘要通過人工感染實驗確定了酵母菌WCY為梭子蟹的病原菌，感染實驗的梭子蟹的癥狀同梭子蟹“乳化病”癥狀相同；通過形態(tài)、生理生化和分子生物學鑒定，鑒定病原酵母菌WCY為梅奇酵母(Metschnikow

2、iabicuspidata)。從海洋中分離的327株酵母中篩選出13株對病原酵母WCY有抑制作用的嗜殺酵母，對其擲菌效果傲了比較，其中菌株YFOTo具有最佳的抑菌效果。通過生理生化和分子生物學方法對海洋嗜殺酵母進行鑒定，結(jié)果顯示在海洋嗜殺酵母中，漢遜德巴利酵母(Debaryornyeeshansenii)、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguflliermond$$)、醬魯蘭類酵母(Aureobasidiumpullulans)和異常畢赤酵

3、母(Pichiaanomala)最常見，其中異常畢赤酵母(Pichiaanomala)的抑菌能力最強。研究了菌株YF07b的嗜殺因子在不同NaCl濃度(O％，3％，6％，8％)、溫度(15，20，25，30，35℃)、pH(40，45，50，60，70，8O)值條件下的抑菌效果。嗜殺因子的最佳作用條件是NaCI濃度8％、pH為45，培養(yǎng)溫度為15℃。研究了菌株YF07b的發(fā)酵培養(yǎng)條件，結(jié)果表明當海洋嗜殺酵母YF07b在溫度為20C，培養(yǎng)

4、基中NaCl濃度為2O％，pH為45時產(chǎn)生嗜殺因子的能力最強。分離篩選的海洋嗜殺酵母YF07b經(jīng)常規(guī)生理生化反應和分子生物學鑒定，為異常畢赤酵母(Pichiaanomala)，根據(jù)陸地嗜殺酵母PichiaanomalastrainK的嗜殺因子(B1，3葡聚糖酶)的基因及相關序列設計引物克隆菌株YF07b的嗜殺因子基因序列，克隆得到的基因序列為1559bp，GenBank登錄號為EF029071。與其它相關蛋白序列對比分析，確定此嗜殺因子

5、基因的編碼區(qū)(ORF框)為209bp到1492bp。克隆基因的推導蛋白為427個氨基酸，推導蛋白與其他酵母菌相關蛋白的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析比對，與異常畢赤酵母(PichiaanomalaStrainK)的親緣關系最近。信號肽分析結(jié)果表明。推導蛋白的前17個氨基酸為信號肽嗜殺因子經(jīng)SephadexG75凝膠過濾和DEAE—SephoroseFastFlow陰離子交換得到純化，經(jīng)SDSPAGE檢測得到分子量為47kDa的單一條帶。純化后