運(yùn)用鑭系金屬探針的順磁及發(fā)光特性研究蛋白質(zhì)相互作用.pdf

1、研究背景:
　　鑭系金屬屬于稀土元素，其中的釓具有良好的順磁特性，而鋱具有良好的發(fā)光特性。在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中，鑭系金屬探針的順磁及發(fā)光特性通過溶液核磁共振及熒光波譜學(xué)技術(shù)，可以被用來標(biāo)記蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的研究。
　　大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system，PTS)中存在著較為復(fù)雜的磷酸化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，其中一條經(jīng)典信號(hào)通路是磷酸基團(tuán)由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依次經(jīng)過酶EⅠ、HP

2、r，最后傳遞給酶EⅡA。酶EⅡA與特定糖類吸收相關(guān)，例如EⅡAGlc，EⅡAMtl和EⅡAMan分別對應(yīng)葡萄糖，甘露醇和甘露糖的吸收。而磷酸基團(tuán)傳遞是依靠相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合體完成的，并且其中很多都是相互作用很弱的瞬時(shí)遭遇復(fù)合體（transient encounter complex）。利用核磁共振(NMR)中的順磁弛豫增強(qiáng)（Paramagnetic relaxation enhancement，PRE）技術(shù)，可以檢測到這些弱相互作用和

3、低豐度復(fù)合體的存在?；诩?xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)化特征和STRING數(shù)據(jù)庫推測，PTS中EⅠ和EⅡA之間可能存在相互作用。因此，采用基于釓的順磁探針，利用PRE NMR技術(shù)對EⅠ和EⅡA間可能的相互作用進(jìn)行研究將是比較適宜的。
　　與PRE技術(shù)相類似，熒光技術(shù)同樣應(yīng)用十分廣泛，特別是在活細(xì)胞等在體實(shí)驗(yàn)中，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)特異性的觀測。但是熒光標(biāo)記的特異性、有效性、穩(wěn)定性以及生物樣本自發(fā)熒光等問題都比較難解決。鋱具有良好的發(fā)光特性，其發(fā)射譜位于

4、可見光區(qū)，并且其熒光壽命達(dá)毫秒級(jí)，可以通過時(shí)間延遲檢測，扣除壽命只有納秒量級(jí)的背景熒光。因此，利用鑭系金屬結(jié)合標(biāo)簽(Lanthanide binding tag，LBT)結(jié)合鋱，并以此作為發(fā)光探針對蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性的標(biāo)記，則可以很好地彌補(bǔ)熒光技術(shù)的不足。
　　半胱氨酰白三烯受體(cysteinyl leukotriene receptor，CysLTR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體，包含CysLT1R和CysLT2R兩種亞型。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)

5、，CysLTR與腦缺血損傷病理過程密切相關(guān)。但是，限于現(xiàn)有的技術(shù)手段，對CysLTR的研究還不是很深入，CysLTR的結(jié)構(gòu)、寡聚狀態(tài)、動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)和配體識(shí)別機(jī)制等問題都亟待研究解決，而首要的任務(wù)就是對CysLTR進(jìn)行合適的標(biāo)記。
　　研究目的:
　　采用基于釓的順磁探針，利用PRE NMR技術(shù)對EⅠ和EⅡA間的相互作用進(jìn)行研究，以驗(yàn)證大腸桿菌PTS中一條非經(jīng)典通路的存在;通過LBT結(jié)合鋱作為發(fā)光探針對人半胱氨酰白三烯受體(hCy

6、sLTR)進(jìn)行標(biāo)記，并實(shí)現(xiàn)在活細(xì)胞中的觀察。
　　研究方法及結(jié)果:
　　第一部分利用釓的順磁特性研究大腸桿菌磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的非經(jīng)典通路
　　通過EⅠN（EⅠ的N端結(jié)構(gòu)域）和EⅡAmtl之間的NMR滴定實(shí)驗(yàn)，以及分別向EⅡAMtl E69C突變體、EⅡAGlc E97C和D144C突變體引入Gd3+-EDTA-benzyl-acetate順磁探針后與EⅠN間的PRENMR實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)了EⅠ和EⅡA之間存在著極弱的相互作

7、用，其平衡解離常數(shù)Kd約為13mM，并且確定了可能的相互作用界面。
　　通過體外NMR實(shí)驗(yàn)測定磷酸化酶促反應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)EⅡAGlc，EⅡAMtl和EⅡAMan都是可以被EⅠ直接磷酸化的。并且，HPr-H15A酶活缺失突變體對EⅡA被EⅠ直接磷酸化的過程有抑制效應(yīng)。這提示EⅡA被EⅠ磷酸化的過程可以沒有HPr的參與。
　　最后，通過測定△ptsH以及△ptsH-H15A菌株在單一碳源極限培養(yǎng)基中的生長曲線和糖源消耗曲線，我們發(fā)

8、現(xiàn)在細(xì)菌體內(nèi)，EⅡA也是可以被EⅠ直接磷酸化的。這說明EⅠ和EⅡA間的相互作用是具有生理意義的。
　　第二部分利用鋱的發(fā)光特性在活細(xì)胞中標(biāo)記人半胱氨酰白三烯受體2
　　通過分子生物學(xué)方法在hCysLTlR和hCysLTR蛋白N末端及細(xì)胞膜外三個(gè)loop環(huán)區(qū)設(shè)計(jì)位點(diǎn)，分別插入LBT，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞，表達(dá)含有LBT突變的hCysLTR蛋白。
　　利用hCysLTR的激動(dòng)劑白三烯D4(LTD4)刺激轉(zhuǎn)染細(xì)胞，

9、通過Fluo-4測定細(xì)胞內(nèi)鈣增高來判斷受體功能是否受到突變的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將含LBT的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后，與轉(zhuǎn)染野生型受體相比，N末端連接LBT后，LTD4刺激不能引起細(xì)胞內(nèi)鈣增高，而分別在胞外不同loop區(qū)插入的LBT，則對LTD4引起的細(xì)胞內(nèi)鈣增高無顯著影響。
　　通過光學(xué)顯微鏡成像和MTT法檢測，發(fā)現(xiàn)濃度為0.1 nM-1μM的Tb3+對HEK-293細(xì)胞的形態(tài)及活性無明顯影響。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明LBT

10、結(jié)合Tb3+作為發(fā)光探針，可以進(jìn)一步用于hCysLTR的膜外loop區(qū)的標(biāo)記檢測實(shí)驗(yàn)。
　　最后，我們通過多功能酶標(biāo)儀和多光子顯微鏡在活的HEK-293細(xì)胞中觀察到了Tb3+對hCysLTR的標(biāo)記。
　　結(jié)論:
　　借助釓的順磁特性，通過PRE NMR實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)了EⅠ和EⅡA之間具有極弱的相互作用，并且能夠直接傳遞磷酸基團(tuán)，因此證明了大腸桿菌PTS中由EⅠ直接到EⅡA的非經(jīng)典信號(hào)通路的存在。
　　利用鋱的發(fā)光