蜂毒肽和神蜂精抗HSV-1病毒作用及其機(jī)理研究.pdf

1、本文考察了采用層析法分離蜂毒得到的純蜂毒肽和神蜂精(內(nèi)含蜂毒肽0.05 mg/ml的中藥外搽劑)的抗HSV-1病毒作用,同時(shí)對(duì)其抗HSV-1病毒的機(jī)理進(jìn)行了探索,并研究了HSV-1感染后小鼠腦細(xì)胞中p53和p21 WAF1/CIP1蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果如下：
　　 ⑴QF-1取毒器蜂箱內(nèi)取毒法采集意大利蜜蜂的蜂毒,過濾提純蜂毒后經(jīng)葡聚糖凝膠G-25,G-50,G-75層析和溶血試驗(yàn)分離純化后得到蜂毒肽。經(jīng)SDS-PAGE電泳Ma

2、rker及蜂毒肽標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)分離所得的組分進(jìn)行鑒定,證實(shí)其為電泳級(jí)純度的蜂毒肽,利用分離所得的蜂毒肽進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　 ⑵CPE法測(cè)定并經(jīng)過Reed-Meuench法計(jì)算得出HSV-1病毒的半數(shù)感染量TCID50為10-5.2/100uL,MTT法測(cè)定并和Reed-Meuench法計(jì)算得出蜂毒肽和神蜂精對(duì)Vero細(xì)胞的半數(shù)中毒劑量CC50分別為10-2.1mg/100uL和10-2.4mg/100uL。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1、3、6、

3、9倍CC50的蜂毒肽對(duì)HSV-1病毒的抑制率分別為55.12％,55.12％,59.30％,66.51％,藥物對(duì)照組(阿昔洛韋試驗(yàn)組)的抑制率為74.88％。四個(gè)梯度濃度的神蜂精對(duì)HSV-1病毒的抑制率分別為69.50％,71.52％,62.11％,45.74％,阿昔洛韋試驗(yàn)組的抑制率為75.34％。
　　 ⑶體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明蜂毒肽和神蜂精均有提高小鼠存活率和延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間的作用。蜂毒肽在低、中和高劑量(1×10-3mg/mL

4、,3×10-3mg/mL,6×10-3mg/mL)時(shí)小鼠的存活率分別為40％,40％和50％。神蜂精試驗(yàn)組的小鼠存活率分別為40％,50％和60％,均高于病毒對(duì)照組的20％。蜂毒肽試驗(yàn)組小鼠的平均存活時(shí)間分別為11.4d,12d,12.7d,中、高劑量蜂毒肽試驗(yàn)組的平均存活時(shí)間明顯高于病毒對(duì)照組(p＜0.05)。神蜂精試驗(yàn)組小鼠的平均存活時(shí)間分別為11.6d,11.8d,12.8d,明顯高于病毒對(duì)照組(p＜0.05)。高劑量組的蜂毒肽和

5、神蜂精的小鼠平均存活時(shí)間均高于陽性對(duì)照組(阿昔洛韋試驗(yàn)組)。
　　 ⑷蜂毒肽和神蜂精的抗HSV-1病毒機(jī)理的研究結(jié)果表明,蜂毒肽和神蜂精沒有直接殺死HSV-1病毒的作用,但是對(duì)HSV-1病毒的吸附、合成和釋放均有明顯的抑制作用。1CC50,3CC50,6CC50,9CC50的蜂毒肽對(duì)HSV-1病毒的吸附均有抑制作用,抑制率分別為31.25％,32.92％,32.92％,32.08％。四個(gè)梯度濃度1CC50,3CC50,6CC50

6、,9CC50的神蜂精對(duì)HSV-1病毒吸附的抑制率分別為29.17％,31.25％,32.08％,32.08％。四個(gè)梯度濃度的蜂毒肽對(duì)HSV-1病毒合成的抑制率分別為29.05％,29.91％,31.69％,33.06％。四個(gè)梯度濃度的神蜂精對(duì)HSV-1病毒合成的抑制率分別為23.12％,23.49％,24.25％,23.72％。四個(gè)濃度的蜂毒肽對(duì)HSV-1病毒釋放的抑制率分別為29.31％,18.37％,13.28％,10.70％。四個(gè)

7、梯度濃度的神蜂精對(duì)HSV-1病毒釋放的抑制率分別為42.89％,33.77％,31.32％,30.67％。
　　 ⑸小鼠在注射0.05 mL100LD50 HSV-1病毒液感染后,連續(xù)兩天進(jìn)行蜂毒肽和神蜂精腹腔注射給藥,小鼠感染病毒后第4天進(jìn)行免疫組化試驗(yàn),結(jié)果顯示：正常試驗(yàn)組,病毒對(duì)照組,低、中、高劑量蜂毒肽組,低、中、高劑量神蜂精組小鼠的腦細(xì)胞p21 WAF1/CIP1蛋白陽性細(xì)胞率分別為100％,2.1％±0.6,14.2

8、％±0.4,28.5％±0.6,33.8％±0.8,13.7％±0.5,22.3％±0.4,29.4％±0.6。各試驗(yàn)組小鼠腦細(xì)胞的p53蛋白的陽性細(xì)胞率分別為3.5％±0.2,40.2％±0.5,31.2％±0.5,22.4％±0.4,20.5％±0.3,27.3％±0.6,20.9％±0.3,14.1％±0.2。經(jīng)層析分離蜂毒得到的電泳級(jí)純度的蜂毒肽和蜂毒制劑神蜂精通過抑制病毒的吸附、合成和釋放,從而達(dá)到體內(nèi)外抗HSV-1病毒的作用

9、,進(jìn)而調(diào)節(jié)小鼠腦細(xì)胞p21 WAF1/CIP1和p53蛋白的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,保護(hù)細(xì)胞DNA免受HSV-1的損傷。神蜂精中蜂毒肽的含量約為0.05 mg/mL,100uL1CC50神蜂精所含蜂毒肽約為0.0002 mg,100uL1CC50蜂毒肽溶液含蜂毒肽0.00799mg。神蜂精中的蜂毒肽含量只有相應(yīng)試驗(yàn)濃度的蜂毒肽溶液的1/40。比較試驗(yàn)組神蜂精和蜂毒肽的體內(nèi)外抗HSV-1病毒的能力,抑制病毒吸附、合成和釋放的能力,對(duì)蛋白p53