可系統(tǒng)性給藥的蜂毒肽脂質(zhì)納米顆粒及其抗黑色素瘤作用研究.pdf

1、蜂毒肽，作為蜂毒的主要成分，是一種具有α螺旋結構的兩親性多肽。蜂毒肽在疾病治療上有廣泛的應用，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒、抗輻射和降血壓等作用。蜂毒肽應用于腫瘤治療具有獨特優(yōu)勢，能夠在質(zhì)膜上打孔造成細胞裂解死亡，從而避開了腫瘤的耐藥性問題。然而，蜂毒肽自身存在的溶血性問題、非特異性作用以及易被代謝降解等缺點，嚴重阻礙了其在抗腫瘤方面的臨床應用。如何在活體內(nèi)安全有效地運輸蜂毒肽抵達腫瘤組織而不產(chǎn)生毒副作用，仍是極具挑戰(zhàn)的難題。本文采用以

2、仿HDL多肽脂質(zhì)納米顆粒為基礎的運載方法，有效地解決了蜂毒肽在活體腫瘤治療中存在的溶血問題，并延長了其在體內(nèi)的循環(huán)周期，而且實現(xiàn)了在腫瘤區(qū)域特異性地釋放，主要取得了以下研究結果：
　　（1）發(fā)明了一種新型的含蜂毒肽的功能性雜化多肽α-melittin。它是由蜂毒肽與一條α螺旋結構的載脂蛋白模擬肽（α-peptide）通過共價連接而成。α-melittin在保留了蜂毒肽的自發(fā)形成多聚體和裂解細胞等屬性的基礎上，具有更強的磷脂親和力以

3、及α螺旋結構形成能力。與α-peptide相比，α-melittin具有更強大的粒徑控制力，能夠?qū)⒘字纬傻募{米顆粒粒徑控制在10nm左右甚至更小，同時具有很高的包封率（>80％）。
　?。?）利用α-melittin合成的脂質(zhì)納米顆粒α-melittin-NP，實現(xiàn)了活體內(nèi)蜂毒肽的安全有效遞送。α-melittin-NPs是一種粒徑在14nm左右，分散性良好的球形納米顆粒，其核心可以同時運載疏水性分子。α-melittin-NP

4、s性質(zhì)穩(wěn)定，在血清和血漿等生理溶液中仍然保持穩(wěn)定的納米結構。憑借蜂毒肽與α-peptide羧基端疏水性氨基酸的連接設計以及α-melittin與磷脂層的強力結合，α-melittin-NPs有效地隱藏了蜂毒肽的陽離子電荷（21.33±1.64mV），表現(xiàn)為近中性納米顆粒（2.45±0.56mV）。α-melittin-NPs明顯降低了蜂毒肽的溶血性和非特異性破壞作用。體外溶血實驗表明，α-melittin-NPs對血細胞的裂解作用顯著降

5、低，即使在50μM的高濃度下也只有8%左右的溶血率。細胞增殖實驗顯示，α-melittin-NPs對細胞生長抑制的IC50值（11.26±1.37μM）較蜂毒肽（1.71±0.04μM）有顯著的提升。激光共聚焦連續(xù)成像的結果表明，α-melittin-NPs與黑色素瘤細胞接觸后造成細胞膜通透性改變，誘導細胞內(nèi)容物泄漏、細胞核分解，最終導致細胞死亡。Annexin V-FITC/PI的雙色標記和流式分析結果表明，α-melittin-NP

6、s導致腫瘤細胞死亡的主要途徑是發(fā)生壞死，也能誘導少量細胞發(fā)生凋亡。最后，α-melittin-NPs通過尾靜脈注射至皮下荷瘤鼠體內(nèi)。經(jīng)過4次給藥治療，黑色素瘤的生長得到了明顯抑制，與對照組相比其抑制率高達82.8%。與此同時，通過對治療小鼠血液的生理生化指標的檢測，以及對臟器的病理切片分析，并未顯示α-melittin-NPs對機體產(chǎn)生明顯的毒副作用。
　?。?）研制同步運輸紫杉醇和蜂毒肽的超小納米顆粒(PTX-OL)α-meli

7、ttin-NPs，具有協(xié)同抗黑色素瘤的作用。利用激光共聚焦顯微鏡觀察到α-melittin-NPs在與腫瘤細胞相互作用時，會將蜂毒肽釋放至包括質(zhì)膜在內(nèi)的膜系統(tǒng)上，而核心內(nèi)的染料分子則被直接釋放至胞漿中。(PTX-OL)α-melittin-NPs在兩個治療機制上充分發(fā)揮了紫杉醇和蜂毒肽的抗腫瘤功能。腫瘤細胞增殖實驗的結果顯示，(PTX-OL)α-melittin-NPs對黑色素瘤殺傷效率明顯增強，IC50值是α-melittin-NPs

8、的44.8%。Annexin V-FITC/PI雙色標記和流式分析結果表明，相比于α-melittin-NPs，(PTX-OL)α-melittin-NPs能夠誘導更多細胞發(fā)生壞死，提升幅度為10-20%。而且，在活體黑色素瘤治療上，(PTX-OL)α-melittin-NPs同樣展現(xiàn)出增強的腫瘤生長抑制效果。
　　綜上所述，本研究利用仿HDL多肽脂質(zhì)納米顆粒作為蜂毒肽的運載體，通過將蜂毒肽隱藏在單層磷脂分子層內(nèi)，有效地解決了其在