新型mTOR抑制劑Y31抑制人多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖及機(jī)制研究.pdf

1、常染色體顯性多囊腎病(ADPKD)是人類最常見的單基因遺傳性腎病，發(fā)病率約為1/1000～1/400,據(jù)此估計(jì)我國(guó)ADPKD患者約有150萬(wàn)[1]。大約一半ADPKD患者在60歲時(shí)最終發(fā)展至終末期腎病[2]。ADPKD主要病理特征是雙腎廣泛形成液性囊腫，并進(jìn)行性增大，最終破壞腎臟正常結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)展至終末期腎臟疾病，需血液透析治療。ADPKD的發(fā)病機(jī)制目前尚未被完全闡明，也未找到有效的治療藥物?，F(xiàn)今ADPKD的研究仍主要集中在囊腫形成過

2、程中的細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)制，希望能尋找到新的治療靶點(diǎn)和有效的藥物。
　　 mTOR(mammaliantargetofrapamycin，)信號(hào)通路參與ADPKD的發(fā)生、發(fā)展過程已得到公認(rèn)，且有多項(xiàng)研究也顯示，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和多種ADPKD模型動(dòng)物中，mTOR抑制劑雷帕霉素具有抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖和腎囊腫形成的作用[3]；前期的臨床試驗(yàn)結(jié)果也提示雷帕霉素在ADPKD發(fā)展的不同階段均呈現(xiàn)出有效的治療效果，且未發(fā)生雷帕霉素的副

3、作用。但是，近期國(guó)外權(quán)威雜志報(bào)道了兩個(gè)傳統(tǒng)mTOR抑制劑治療ADPKD的臨床試驗(yàn)結(jié)果，證明單用傳統(tǒng)mTOR抑制劑對(duì)ADPKD患者治療效果不甚明顯。
　　 為此，我們?cè)谂c中科院藥物所合作共同研制新型mTOR抑制劑Y31，其藥代動(dòng)力學(xué)及水溶性都優(yōu)于雷帕霉素。旨在觀察其對(duì)腎囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響及機(jī)制，探討Y31應(yīng)用于臨床治療ADPKD的前景。
　　 實(shí)驗(yàn)所用的WT9-12細(xì)胞株由美國(guó)哈佛大學(xué)周京教授饋贈(zèng)，是來

4、源于人ADPKD患者腎臟囊腫襯里上皮永生化的細(xì)胞系。WT9-12細(xì)胞在分別給予不同濃度的Y31干預(yù)培養(yǎng)24、48、72和96h后，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示Y31可明顯抑制WT9-12細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量的依賴性，其作用72h的50％抑制率濃度為25μmol/L。流式細(xì)胞技術(shù)分析結(jié)果顯示W(wǎng)T9-12細(xì)胞在給予濃度為25μmol/L的Y31作用72h后，可明顯阻滯細(xì)胞周期，使之被阻滯于G0/G1期，使G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加了將近10％；

5、同時(shí)也誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞早期凋亡率增加近28.5％，兩者較對(duì)照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)都表現(xiàn)明顯差異(P<0.05)。此外，Westernblot方法檢測(cè)結(jié)果提示，WT9-12細(xì)胞在給予濃度為25μmol/L的Y31作用72h后，其細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控蛋白p21的表達(dá)明顯增加，而cyclinD的表達(dá)卻減少；反映細(xì)胞凋亡的PARP蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)。綜上所述，表明mTOR抑制劑Y31對(duì)WT9-12細(xì)胞增殖的抑制作用是通過阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期和促進(jìn)細(xì)

6、胞凋亡的機(jī)制實(shí)現(xiàn)，與流式細(xì)胞技術(shù)分析的結(jié)果相符。
　　 mTOR信號(hào)通路在多囊腎病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，抑制mTOR信號(hào)通路可明顯抑制多囊。腎病的進(jìn)展，p70S6K及4E-Bp1是mTOR兩個(gè)主要的下游底物。在給予WT9-12細(xì)胞不同濃度的Y31作用72h后，Westernblot方法檢測(cè)結(jié)果顯示Y31可下調(diào)p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達(dá)，而對(duì)另一個(gè)底物4E-Bp1的磷酸化水平卻無(wú)明顯影響。
　　 細(xì)胞死亡的

7、形式有細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬。mTOR信號(hào)通路除了調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡外，同時(shí)又是細(xì)胞自噬的重要調(diào)節(jié)蛋白。已有多項(xiàng)研究表明自噬增加有抑癌效應(yīng)，過量自噬導(dǎo)致的自噬性死亡可以殺滅腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了細(xì)胞自噬相關(guān)的重要蛋白LC3和Beclin1，結(jié)果顯示Y31可使LC3和Beclin1表達(dá)增加，表明Y31可促進(jìn)細(xì)胞自噬性死亡，細(xì)胞自噬是Y31抑制WT9-12細(xì)胞增殖的另一機(jī)制。
　　 總之，本研究表明新型mTOR抑制劑Y31主要作用